Name: protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

この作品は、NIH / NIDCRグラント1R01DE019796によってサポートされていました。

提示LEO-ワークフローはタンパク質消化物や合成ペプチドの安定同位体標識を可能にします。これらのタイムコース実験（ 図1）は、比較および定量的プロテオミクス研究ならびにプロテアーゼの研究にも適用可能である。各ワークフローには、2つの実験の手順（ 図2）から構成されています）は、それぞれ18のO-安定同位体でエンコードされた反応（プロテア...

<ol>
	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics.">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li><li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics.">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li><li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+proteolytic+18O+labeling:+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates.">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li><li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples.">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li><li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1:+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling.">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li><li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3.">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156 (2009).</li><li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters.">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li><li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry.">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

時間分解方法で、安定同位体標識と​​高分解能質量分析を組み合わせることで、古経時方法は、ペプチド生成物の生成の動的解析が可能になります。アッセイは、定量的および定性的プロテオミクス研究のための安定同位体で標識されたペプチドを生成するとプロテオティピックペプチドが生成されることにより反応速度を評価するために用いることができる。さらに、古経時は、特定の?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> PepClean C-18スピンカラム</td><td>サーモ</td><td> 89870 </td></tr><tr><td>のOpti-TOF 384 MALDIターゲットプレート</td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> 表1材料<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>アルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td&gt;アクロス</td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド（IAM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td>酵素-1（ECE-1）を変換エンドセリン</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td>トリプシンゴールド</td><td>プロメガ</td><td> V5280 </td></tr><tr><td>水- 18 O、97原子％ の18 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸（TFA） </td><td>サーモ</td><td> 28904 </td></tr><tr><td> AB SCIEX TOF / TOF機器のキャリブレーションのための質量標準キット</td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> 表2試薬

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

安定同位体は、生物学質量分析に不可欠なツールです。歴史的に見ると、18 O安定同位体は、広範囲に1から3のタンパク質分解酵素の触媒機構を研究するために使用されている。質量分析ベースのプロテオミクスの出現により、安定同位体濃縮された水の18 O原子の酵素によって触媒された定款は、定量的タンパク質発現レベル（Fenselauとヤオ4県、宮城県、ラオ5とYeによって見直さ比較する一般的な方法となっているら6）18 O標識は、化学物質（ 例えば iTRAQ、ICAT）と（ 例えば SILAC）代謝標識技術7に簡単かつ低コストの代替手段を構成する。利用プロテアーゼに応じて、18 O標識は、切断産物3のC末端カルボキシル基に2つの18 O原子までの取り込みをもたらすことができ</sup&gt;。標識反応は、2つの独立したプロセスが、ペプチド結合切断とカルボキシル酸素交換反応8に細分することができる。酵素18 O標識の私たちのパレオ（P 18 O濃縮水をmploying 電子 abeling rotease-ssisted リットル ）の適応では、独特の同位体比の挙動を得るために50パーセント18 O濃縮水を利用した。高解像度のマトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間型タンデム質量分析（MALDI-TOF/TOF MS / MS）との組み合わせでは、特徴的な同位体エンベロープは特異性の高いレベルで切断産物を同定するために用いることができる。我々は以前に検出し、特徴づける内因性プロテアーゼ9とタンパク質分解反応10-11を監視するために古の方法論を使用してきました。パレオは、タンパク質分解的切断反応の本質をエンコードしているので、実験のセットアップは簡単で、生化学ENRIです切断産物のchmentステップは回避することができます。古法は容易にタンパク質分解的切断反応のダイナミクスと生理的条件を表す複雑な生物学的サンプル中のタンパク質分解の（ii）の分析の監視（i）が経時実験に拡張することができます。古経時実験は、複雑なタンパク質分解経路反応における律速処理ステップと反応中間体を識別するのに役立ちます。さらに、古反応は、私たちはそのようなその切断産物を再結合し、第二18 O原子の取り込みを触媒することが可能であるセリンプロテアーゼトリプシンなどのタンパク質分解酵素を識別することができます。このような&quot;二重標識&quot;酵素はペプチドが排他的にカルボキシル酸素交換反応によって標識されている、postdigestion 18 O標識のために使用することができます。私たちの3番目の戦略は酵素を超え18 O濃縮水を採用ラベリング延び、18 O安定同位体標識を導入するために酸性のpH条件を使用していますペプチドにatures。

我々は、動的にタンパク質分解酵素によって生成されたペプチドの切断産物に18 O安定同位体の取り込みを監視するために古経時ワークフローを使用していました。提示されたアプローチは比較的異なる基板とプロテアーゼの組み合わせに分解性プロセシング経路を研究するための多目的ツールです。反応の過程で繰り返しタンパク質分解反応をサンプリングすることにより、古経時?...

Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

採用した安定同位体標識のワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水（LEO-ワークフロー）を定量的および定性的プロテオミクス研究のための多目的ツールです。プロテアーゼアシスト（古）のワークフローでは、<sup&gt; 18</sup&gt; O原子は、タンパク質分解切断、およびプロテアーゼによって媒介されるカルボキシル酸素交換反応によって導入されます。酸触媒（アレオ）ワークフローでは、<sup&gt; 18</sup&gt; O原子は低pHでカルボキシル酸素交換によって導入されます。

採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Morris Water Maze Experiment

モリス水迷路実験

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

TEM Workflows, Results Analysis, and Data Management Using a Machine-Vision Approach

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management (Video) | JoVE 

透過型電子顕微鏡ワークフロー、結果分析、データ管理へのマシンビジョンアプローチ

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

High-Throughput Screening Analysis for 4B Cysteine Peptidase Autophagy Inhibitor

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

A Selective Luciferase-Based Assay for Monitoring ATG4B 27 Activity in Cells (Video) | JoVE

オートファジー関連4Bシステインペプチダーゼ阻害剤の細胞ベースの薬物スクリーニング

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...