Name: protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

De presenterade LEO-arbetsflöden möjliggöra stabila isotopen märkning av protein smälter och syntetiska peptider. Dessa tidsförloppsdata experiment (figur 1) är tillämpliga på jämförande och kvantitativa proteomik studier samt proteas forskning. Varje arbetsflöde består av två experimentella steg (figur 2): A) tidsupplöst provtagning av respektive 18 O-stabil isotop-kodad reaktion (proteas-katalyserad peptidklyvning, proteas-katalyserad karboxylgrupp syreutbyte...

<ol>
	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics.">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li><li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics.">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li><li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+proteolytic+18O+labeling:+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates.">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li><li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples.">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li><li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1:+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling.">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li><li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3.">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156 (2009).</li><li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters.">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li><li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry.">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Genom att kombinera en stabil isotop märkning och högupplösande masspektrometri i en tidsupplöst sätt tillåter paleo-tidsförloppet metod för en dynamisk analys av alstring av peptid-produkter. Analysen kan användas för att generera stabila isotopiskt märkta peptider för kvantitativa och kvalitativa proteomik studier och utvärdera kinetiken genom vilka proteotypic peptider genereras. Dessutom är paleo-tidsförloppet syftar till att utvärdera proteolytiska vägar under specifika, fysiologiskt relevanta för...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> PepClean C-18 spinnkolonner </td><td> Thermo </td><td> 89.870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI måltavla </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Material <table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Alfa cyano-4-hydroxikanelsyra </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70.990-1G-F </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Jodacetamid (lAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endothelinomvandlande enzym-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Trypsin Guld </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Vatten-18 O, 97 atom% 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329.878-1G </td></tr><tr><td> Trifluorättiksyra (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28.904 </td></tr><tr><td> Mass Standards Kit för kalibrering av AB Sciex TOF / TOF instrument </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Reagens

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Stabila isotoper är viktiga verktyg i biologisk masspektrometri. Historiskt har 18 O-stabila isotoper i stor utsträckning använts för att studera de katalytiska mekanismer av proteolytiska enzymer 1-3. Med tillkomsten av masspektrometri-baserade proteomik har enzymatiskt-katalyserad inkorporering av 18 O-atomer från stabil isotopanrikning vatten blivit en populär metod för att kvantitativt jämföra nivåerna proteinuttryck (granskad av Fenselau och Yao 4, Miyagi och Rao 5 och Ye et al. 6). 18 O-märkning är en enkel och billig alternativ till kemisk (t.ex. iTRAQ, ICAT) och metabola (t.ex. SILAC) tekniker märkning 7. Beroende på den utnyttjade proteaset, kan 18 O-märkning resultera i införlivandet av upp till två 18 O-atomer i den C-terminala karboxylgruppen av klyvningsprodukten 3 </sup&gt;. Märkningen Reaktionen kan delas upp i två oberoende processer, peptidbindningen klyvning och karboxylgruppen syreutbytet reaktion 8. I vår Paleo (p rotease-en ssisted L abeling e mploying 18 O-berikat vatten) anpassning av enzymatisk 18 O-märkning, utnyttjade vi 50% 18 O-berikade vattnet för att ge distinkta isotop signaturer. I kombination med hög upplösning matris-assisterad laser desorption jonisering time-of-flight tandem-masspektrometri (MALDI-TOF/TOF MS / MS), kan de karakteristiska isotopen kuvert användas för att identifiera klyvningsprodukter med en hög grad av specificitet. Vi har tidigare använt Paleo-metoden för att upptäcka och karakterisera endogena proteaser 9 och övervaka proteolytiska reaktioner 10-11. Sedan paleo kodar själva kärnan i den proteolytiska klyvningen reaktionen är experimentuppställning enkel och biokemiska Enrichment steg klyvningsprodukter kan kringgås. Den Paleo-metoden kan lätt utvidgas till (i) experiment tidsförloppsdata som övervakar dynamiken i proteolytisk klyvning reaktioner och (ii) analys av proteolys i komplexa biologiska prover som representerar fysiologiska förhållanden. Paleo-tidsförloppet experiment hjälper identifiera hastighetsbegränsande processteg och intermediärer reaktionsprodukter i komplexa proteolytiska pathway reaktioner. Vidare medger paleo-reaktionen oss att identifiera proteolytiska enzymer såsom serinproteaset trypsin som är kapabel att binda sina klyvningsprodukter och katalyserar införlivandet av en andra 18 O-atomen. Sådana &quot;dubbla&quot; märkning enzymer kan användas för postdigestion 18 O-märkning, i vilka peptider uteslutande märkta av karboxyl syreutbytet reaktion. Vår tredje strategi sträcker märkning sysselsätter 18 O-berikade vattnet utanför enzymer och använder sura pH-förhållanden för att införa 18 O-stabil isotop skyltrer till peptider.

Vi använde Paleo-tidsförloppet arbetsflöde för att dynamiskt övervaka införlivandet av 18 O-stabila isotoper i peptid klyvningsprodukter genereras av proteolytiska enzymer. Den presenterade metoden är ett mångsidigt verktyg för att jämförelsevis studera proteolytiska bearbetning vägar för olika substrat och kombinationer proteas. Genom provtagning proteolytiska reaktioner gånger under loppet av reaktionen ger Paleo-tidsförloppet experiment tidsupplöst ögonblicksbilder av substrat och abundanc...

Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stabil isotop märkning arbetsflöden som använder<sup&gt; 18</sup&gt; O-berikade vattnet (Leo-arbetsflöden) är mångsidiga verktyg för kvantitativa och kvalitativa proteomik studier. I proteas-assisted (Paleo) arbetsflöden,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomer införs genom proteolytisk klyvning och karboxyl syre reaktioner utbyte förmedlas av proteaser. I den syrakatalyserade (Aleo) arbetsflöde,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomer införs med karboxyl syreutbytet vid lågt pH.

Proteas-och syrakatalyserad Namnge Arbetsflöden Anställa<sup&gt; 18</sup&gt; O-anrikade Vatten

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mätning exocytos i de nervceller Använda FM-märkning

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Morris Water Maze Experiment

Morris water maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Sigmas Ospecifika Protease Activity-analys - Kasein som substrat

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescerande märkning av Drosophila Heart strukturer

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Användning av Protease Fluorescent Detection Kit Avgöra Protease aktivitet

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Mus Islet Langerhanska Isolering med en kombination av renat kollagenas och neutralt proteas

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Cell Märkning och Injektion i utvecklings Embryonala Mus Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Bestämma membranprotein Topologi Använda Fluorescens Proteas Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

TEM Workflows, Results Analysis, and Data Management Using a Machine-Vision Approach

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management (Video) | JoVE 

En maskinvisionsmetod för arbetsflöden för transmissionselektronmikroskopi, resultatanalys och datahantering

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

High-Throughput Screening Analysis for 4B Cysteine Peptidase Autophagy Inhibitor

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

A Selective Luciferase-Based Assay for Monitoring ATG4B 27 Activity in Cells (Video) | JoVE

Cellbaserad läkemedelsscreening för hämmare av autofagirelaterat 4B-cysteinpeptidas

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...