Name: a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המחלקה למחקר המיפוי של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים יוהנס החופה ומארק דיוויס לתת לנו scFv של H57 שימוש במחקרים אלה. RV רוצה להודות קיאר נוימן לדיון מועיל במהלך הפיתוח של טכניקה זו.

<ol>
	<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor:+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function.">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.T+cell+activation.">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways.">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li><li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+network:+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells.">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li><li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li><li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling.">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li><li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor.">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li><li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling.">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li><li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses.">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li><li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse.">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li><li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse.">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7:+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events.">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li></ol>

כל בעלי החיים המשמשים בניסויים אלה נשמרו בסביבה הפתוגן ללא ספציפי, ואת הניסויים אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות בעלי חיים טיפול ועדת שימוש.

המתואר כאן מערכת ללמוד איתות אנטיגן ספציפי העיקריים טי תאים העכבר באמצעות TIRFM ותמך זכוכית השומנים bilayers כמו נגמ&quot;שים מלאכותיים. הטכניקה מתבססת על בהצלחה לבטא חלבונים GFP מתוייגים בתאים אלה. Transfecting ותאי T היא תמיד משימה מאתגרת. בדרך כלל, electroporation או הגן משלוח באמצעות רטרווירוסים lentiviruses או משמשים. אחת הטכניקות היא לא עדיפה על פני האחר, גם יש מגבלות ויתרונות שלהם. אנו מוצאים electroporation כי יש את היתרונות הבאים: 1) זה לא נדרש כי התאים להיות פעיל חלוקת כנדרש על רטרווירוסים אך לא lentiviruses, ו 2) רמת הביטוי יכול להיות נשלט על ידי שינוי זמן התאים מודגרת לפני הדמיה. החיסרון הגדול ביותר הוא שאנחנו מתקשים מאוד לבטא חלבונים כי הם גדולים בגודל של תאים ראשוניים. הצגנו שיטה נותן לנו כדאיות התא טוב מאוד אחרי electroporation. כתוצאה מכך הוא applicabלה להשתמש בו כדי להשיג בתיווך siRNA להשתקת גנים. כמו כן, אנו מתארים כאן מותאם אישית בו זמנית בערוץ 2 רכישת TIRF מיקרוסקופ, כי הוא תיקן chromatically ואינו דורש יישור נפרד עבור אורכי גל שונים. יכולות אלה, אך הם זמינים מסחרית. המערכת שלנו מבוססת על עקרונות של מיקרוסקופיה TIRF שפורסם על ידי מומחים בתחום, והוא זול יותר מאשר חלופות מסחריות. אחת הביקורת האפשרית של העיצוב שלנו הוא שאנחנו משתמשים באותה זווית של שכיחות עבור אורכי גל עירור שונים. הדבר יביא עומק החדירה TIRF שונה עבור אורכי גל עירור שונים. אנו סבורים כי תופעות אלה הן קטנות בגלל גל חולף הוא שדה מתפורר אקספוננציאלית ואת עומק השדה TIRF היא פונקציה ליניארית של אורך הגל. Fluorophores קרובים לפני השטח זכוכית יחוו הבדל בעוצמות לייזר בין שני אורכי גל. עבור fluorophores ליד PEעומק netration, ההבדל יהיה בעוצמה 1.3 לקפל את שני אורכי גל 488 ו 640 ננומטר 1.15 לקפל עבור שני אורכי גל 488 ו 561 ננומטר. אותה מערכת יכולה לשמש בשילוב עם טכניקות ברזולוציה סופר העושים שימוש בתאורה TIRF. תיארנו גם מערכת 2 המצלמה בנוי מותאם אישית. כמו מערכת TIRF, מנגנונים דומים זמינים גם מבחינה מסחרית. המערכת שלנו מציעה גמישות לשנות את המסננים ואת dichroics, המאפשר את השימוש בו עם שילובים שונים של אורכי גל. החיסרון של המערכת שלנו הוא מידת סיבוב אחד צריך ליישר את שתי התמונות. בעיה זו ניתן לפתור באמצעות עמדות מצלמה כי הם מונעים piezo ולהציע מעלות הסיבוב של יישור. יש לנו גם ליישם בהצלחה מערכת 2 המצלמה על מיקרוסקופ זה, שבו המצלמות הם שונים ויש להם גדלים שונים פיקסל. מערכת כזו תהיה יעילה אם היה צורך ברגישות בערוץ 1 ו dy גדולמגוון namic אחר, הן אלו לעתים נדירות זמין המצלמה זהה. השתמשנו במצלמה HQ-2 Photometrics ב binning 2x2 נותן לנו גודל פיקסל אפקטיבי של 12.9 מיקרומטר עם המצלמה Photometrics קוואנט-EM בעלת גודל פיקסל של 16 מיקרומטר. 180 מ&quot;מ אורך מוקד העדשה הצינור שימש קוואנט-EM ו 145 מ&quot;מ צינור מוקד העדשה אורך שימש המצלמה HQ-2. HQ-2 נשלט באמצעות Metamorph תוכנה קוואנט-EM נשלט באמצעות תוכנת מנהל מיקרו במחשב נפרד במצב טריגר חיצוני. טריגר חיצוני נמסר המצלמה קוואנט-EM באמצעות הפלט הדיגיטלי של לוח מחשוב DAC מדידה, אשר יושמה כמו תריס נוסף על קביעת תצורה של הגדרות תאורה Metamorph. היחס בין אורכי מוקד של עדשות צינור תואם את היחס בין הגדלים פיקסל אפקטיביים. יישור נציג מוצג באיור 5.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector ערכת עכבר לתאי ה-T </td><td> Lonza בע&quot;מ </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure פלסמיד Midiprep Kit </td><td> החיים טכנולוגיות </td><td> K2100-05 </td><td> עבור Preps רעלן פנימי ללא ה-DNA </td></tr><tr><td> Amaxa התקן Nucleofector </td><td> Lonza בע&quot;מ </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> רקומביננטי Murine IL-2 </td><td> Peprotech בע&quot;מ </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent microspheres 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek 8-II גם מחולק לתאים coverglass </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

איתות הוא יזם באמצעות קולטן תא T (TCR) כאשר היא עוסקת באמצעות פפטיד אנטיגני שברי מחויב קומפלקס Histocompatibility רס&quot;ן (pMHC) חלבונים לידי ביטוי על פני השטח של תאים מציגי אנטיגן (נגמ&quot;שים). הקומפלקס TCR מורכב heterodimer TCRαβ מחייב ליגנד המשייך לא קוולנטית עם CD3 הדימרים (את εδ ו εγ heterodimers ו ζζ homodimer) 1. על האירוסין של הקולטן, שרשראות ζ CD3 הם פוספורילציה ע&quot;י קינאז Src המשפחה, Lck. זה מוביל לגיוס של קינאז המשפחה Syk, Zap70, אשר פוספורילציה אז מופעל על ידי Lck. לאחר מכן, Zap70 phosphorylates חלבונים מתאם LAT ו SLP76, שיזם את הקמת מתחם איתות הפרוקסימלי המכיל מספר רב של מולקולות איתות שונות 2. היווצרות של זה בסופו של דבר התוצאות מורכבות בסידן ראס תלוי traגורם nscription הפעלה חניכה הסוגר של הסדרה מורכבת הביטוי תוכניות גנים שיוצרים בידול תא T 2. אותות (TCR לבין המדינה כתוצאה של בידול) הם מווסתת על ידי גורמים רבים אחרים, כולל עוצמה אנטיגן ו crosstalk עם co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, ואת קולטני ציטוקינים 3-4. לימוד הארגון במרחב ובזמן של המתחם איתות הפרוקסימלי בתנאי גירוי שונים היא, אם כן, המפתח להבנת מסלול איתות TCR כמו גם רגולציה על ידי במעברי האותות אחרים. מערכת אחת מודל שימושי מאוד ללמוד איתות ביוזמת TCR על הממברנה בתאי ה-T הוא הנתמכות זכוכית השומנים bilayers, כפי שתואר קודם לכן 5-6. הם יכולים להיות מנוצל כדי להציג pMHC אנטיגני קומפלקסים, הדבקה, ושיתוף גירוי מולקולות בתאי T-משמש נגמ&quot;שים מלאכותיים. על ידי הדמיה של תאים T אינטראקציה עםbilayer השומנים באמצעות הקרינה הכוללת פנימית השתקפות מיקרוסקופ (TIRFM), נוכל להגביל את עירור עד למרחק של 100 מייל ימי של שטח בין זכוכית לבין שטח פני התא 7-8. זה מאפשר לנו תמונה בעיקר את האירועים המתרחשים איתות קרום הפלזמה. כפי שאנו מעוניינים הדמיה לגיוס של איתות חלבונים מורכבים TCR, אנו מתארים מערכת של שתי המצלמה TIRF הדמיה שבה TCR, הנקרא Fab עם ניאון (אנטיגן שבר מחייב) שברי נוגדנים H57 (מטוהרים מן hybridoma H57-597 , ATCC, מספר ATCC: HB-218) שהוא ספציפי עבור TCRβ, ו איתות חלבונים, מתויג עם GFP, ניתן צילמו בו זמנית ובזמן אמת. אסטרטגיה זו הכרחית בשל האופי הדינמי ביותר של שני תאים T ו האירועים איתות שמתרחשים ב TCR. שיטת הדמיה זו אפשרה לחוקרים ligands תמונה יחידה 9-11, כמו גם גיוס של מולקולות איתות לקולטנים מופעלהיא מערכת מצוינת ללמוד ביוכימיה באתרו 12-16.

Watch this Scientific Journal Video about A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins at JoVE.com

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...