Name: a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00
Duration: 16 min 10 s
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Esta pesquisa foi apoiada pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, National Institutes of Health. Somos gratos a Johannes Huppa e Mark Davis para fornecer-nos com o scFv de H57 usada nesses estudos. RV gostaria de agradecer Keir Neumann para discussão útil durante o desenvolvimento desta técnica.

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Todos os animais utilizados nos experimentos foram mantidos em um ambiente livre de patógenos específicos, e os experimentos foram aprovadas pelos Institutos Nacionais de Saúde Animal e Uso Comissão.

Descrevemos aqui um sistema para estudar a sinalização em antigénio específicos células de ratinho primárias T utilizando TIRFM e bicamadas lipídicas de vidro com suporte como APCs artificiais. A técnica baseia-se com sucesso expressando as proteínas GFP etiquetados nestas células. Transfecção de células T é sempre uma tarefa desafiadora. Tipicamente, electroporação ou gene de entrega utilizando retrovírus ou lentivírus são utilizados. Uma técnica não é superior em relação ao outro, ambos têm as suas limitações e vantagens. Descobrimos que a electroporação tem as seguintes vantagens: 1) Não é necessário que as células se dividem activamente como é exigido para os retrovírus, mas não lentivírus, e 2) O nível de expressão pode ser controlada através da variação do tempo as células são incubadas antes de imagem. A maior desvantagem é que achamos muito difícil expressar as proteínas que são de tamanho grande em células primárias. Nós apresentamos um método que nos dá a viabilidade celular muito bom após a eletroporação. Como um resultado disso, é applicable a usá-la para alcançar siRNA silenciamento gênico mediado. Também descrevemos aqui uma personalização de dois canais microscópio TIRF simultânea aquisição que é cromaticamente corrigida e não requer alinhamento separado para comprimentos de onda diferentes. Estas capacidades, no entanto, estão disponíveis comercialmente. Nosso sistema é baseado em princípios de microscopia TIRF publicado por especialistas na área e é mais barato do que as alternativas comerciais. Uma possível crítica de nosso projeto é que nós estamos usando o mesmo ângulo de incidência para os comprimentos de onda de excitação diferentes. Isto resultaria em uma profundidade de penetração diferente TIRF para comprimentos de onda de excitação diferentes. Pensamos que estes efeitos são pequenas, porque a onda evanescente é um campo exponencialmente em decomposição e da profundidade do campo TIRF é uma função linear de comprimento de onda. Fluoróforos próximas da superfície de vidro irá experimentar qualquer diferença na intensidade do laser entre os dois comprimentos de onda. Para fluoróforos perto do PEprofundidade netration, a diferença de intensidade será 1,3 vezes maior para os dois comprimentos de onda 488 e 640 nm e 1,15 de dobragem para os dois comprimentos de onda 488 e 561 nm. O mesmo sistema pode ser utilizado em conjunto com técnicas de resolução super que fazem uso de iluminação TIRF. Nós também descrito um sistema de câmara de duas, que é construído personalizado. Tal como o sistema TIRF, aparelhos semelhantes estão também comercialmente disponíveis. Nosso sistema oferece flexibilidade para mudar os filtros e dicróicas, permitindo sua utilização com diferentes combinações de comprimentos de onda. O inconveniente do nosso sistema é o grau de rotação um necessária para alinhar as duas imagens. Este problema pode ser resolvido usando suportes da câmara que são acionados piezo e oferecem graus de rotação do alinhamento. Também implementada com sucesso um sistema de câmara de dois sobre este microscópio, no qual as câmaras são diferentes e têm tamanhos de pixel diferentes. Um sistema como este seria útil se uma necessária sensibilidade em um canal e um grande dyfaixa dinâmica em outro, ambos os quais são raramente disponível na mesma câmara. Utilizou-se o Photometrics câmara HQ-2 a binning 2x2 nos dando um tamanho de pixel eficaz de 12,9 uM com a câmara de Photometrics Quant-EM que tem um tamanho de pixel de 16 uM. Um tubo de 180 milímetros lente de distância focal foi utilizado para a Quant-EM e uma lente 145 milímetros de comprimento focal tubo foi utilizado para a câmara HQ-2. A HQ-2 foi controlado usando Metamorph software eo Quant-EM foi controlada através do gestor de micro-software em um computador separado no modo de disparo externo. O gatilho externo foi fornecido com a câmera Quant-EM utilizando uma saída digital da placa DAC medição de informática, que foi implementado como um obturador adicional nas configurações configure iluminação de Metamorph. A razão entre as distâncias focais das lentes de tubo corresponde a razão entre os tamanhos de pixel eficazes. Um alinhamento representativo é mostrado na Figura 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit para células T rato </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Para preps endotoxinas livres de DNA </td></tr><tr><td> Amaxa dispositivo Nucleofector </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante IL-2 murina </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microesferas 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-bem câmaras lamela </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

Sinalização é iniciada através do receptor de célula T (TCR) quando ele está envolvida por fragmentos antigénicos peptídicos ligados por Complexo Principal de Histocompatibilidade (pMHC) proteínas expressas na superfície de células apresentadoras de antigénio (APCs). O complexo TCR é composto do heterodímero TCRαβ ligação do ligando que associa não covalentemente com CD3 dímeros (os εδ e εγ heterodímeros e do homodímero ζζ) 1. Após acoplamento do receptor, as cadeias zeta CD3 são fosforilados pela quinase da família Src, Lck. Isto leva ao recrutamento da família Syk quinase, ZAP70, que é então fosforilada e activado por Lck. Depois disso, o adaptador de ZAP70 fosforila as proteínas LAT e SLP76, iniciando a formação do complexo de sinalização proximal contendo um grande número de diferentes moléculas sinalizadoras 2. A formação deste complexo eventualmente resulta em cálcio e Ras-dependente traactivação nscription fator ea consequente início de uma série complexa de programas de expressão génica que dão origem a diferenciação de células T 2. Sinais de TCR (eo estado resultante da diferenciação) são modulados por muitos outros fatores, incluindo a potência antígeno e crosstalk com co-stimulatory/co-inhibitory, quimiocinas e receptores de citocinas 3-4. Estudar a organização espacial e temporal do complexo de sinalização proximal sob condições de estimulação diversas é, portanto, a chave para a compreensão da TCR via de sinalização, bem como sua regulamentação por outras vias de sinalização. Um sistema de modelo muito útil para estudar a sinalização iniciada pelo TCR na membrana plasmática de células T é bicamadas lipídicas de vidro-suportados, como descrito anteriormente 5-6. Eles podem ser utilizados para apresentar complexos antigénicos pMHC, adesão e moléculas co-estimulatórias em células T, que serve como APCs artificiais. Por imagem das células T a interagir com obicamada lipídica usando microscopia de fluorescência interna total reflexão (TIRFM), podemos limitar a excitação para dentro de 100 nm do espaço entre o vidro ea superfície da célula 7-8. Isto permite-nos a imagem em primeiro lugar os eventos de sinalização que ocorre na membrana plasmática. À medida que está interessado em imagiologia o recrutamento de proteínas de sinalização para o complexo TCR, nós descrevemos um de dois câmara TIRF sistema de imagem, em que o TCR, rotulado com Fab fluorescente (antigénio fragmento de ligação) fragmentos do anticorpo H57 (purificada a partir de hibridoma H57-597 , ATCC Número, ATCC: HB-218) que é específico para TCRβ, e as proteínas de sinalização, marcado com GFP, pode ser trabalhada em simultâneo e em tempo real. Esta estratégia é necessário devido à natureza altamente dinâmico de ambas as células T e dos eventos de sinalização que estão a ocorrer no TCR. Esta modalidade de imagem tem permitido aos pesquisadores ligantes de imagens simples 9-11, bem como o recrutamento de moléculas sinalizadoras a receptores ativados eé um excelente sistema para estudar bioquímica in-situ 12-16.

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

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Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Imunologia e Infecção

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Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

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