Name: a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins at JoVE.com

Denna forskning stöddes av avdelningen för Interna Forskning av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health. Vi är tacksamma för Johannes Huppa och Mark Davis för att ge oss med scFv av H57 som används i dessa studier. RV vill tacka Keir Neumann för hjälp diskussion under utvecklingen av denna teknik.

<ol>
	<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor:+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function.">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.T+cell+activation.">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways.">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li><li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+network:+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells.">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li><li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li><li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling.">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li><li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor.">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li><li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling.">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li><li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses.">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li><li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse.">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li><li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse.">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7:+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events.">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li></ol>

Alla djur som används i dessa experiment bibehölls i en specifik patogenfri miljö, och experimenten godkänt av National Institute of Health Animal Care and Use Committee.

Vi beskriver här ett system för att studera signalering i antigen-specifika primära celler mus-T med TIRFM och glas som stöds lipiddubbelskikt som konstgjorda APC. Tekniken förlitar sig på ett framgångsrikt uttrycker GFP-märkta proteinerna i dessa celler. Transfektera T-celler är alltid en utmaning. Normalt är elektroporation eller gentillförsel använda retrovirus eller lentivirus användas. En teknik är inte överlägsen den andra, båda har sina begränsningar och fördelar. Vi finner att elektroporation har följande fördelar: 1) Det är inte krävs att cellerna aktivt delar som krävs för retrovirus men inte lentivirus, och 2) Uttrycket nivån kan kontrolleras genom att variera tiden cellerna inkuberas vid avbildning. Den största nackdelen är att vi har mycket svårt att uttrycka proteiner som är stora i storlek i primära celler. Vi har presenterat en metod som ger oss mycket bra cellviabiliteten efter elektroporering. Som ett resultat är det applicable att använda den för att få siRNA tystas medierad gen. Vi beskriver också här en skräddarsydd två-kanals simultan mikroskop förvärvet TIRF som kromatiskt korrigeras och inte kräva separat justering för olika våglängder. Denna förmåga, men är kommersiellt tillgängliga. Vårt system bygger på principerna om TIRF mikroskopi publiceras av experter på området och är billigare än kommersiella alternativ. En möjlig kritik av vår design är att vi använder samma infallsvinkel för de olika exciteringsvåglängder. Detta skulle resultera i en annorlunda TIRF penetrationsdjup för olika exciteringsvåglängder. Vi tror att dessa effekter är liten eftersom den evanescenta vågen är en exponentiellt avklingande fält och djupet av den TIRF fältet är en linjär funktion av våglängden. Fluoroforer nära glasytan kommer att uppleva några skillnader i laserintensiteter mellan de två våglängderna. För fluoroforer nära penetration djup, kommer intensiteten skillnaden 1,3-faldig för de två våglängderna 488 och 640 nm och 1,15 vik för de två våglängderna 488 och 561 nm. Samma system kan användas i kombination med super upplösning tekniker som utnyttjar TIRF belysning. Vi har också beskrivit ett två kamera system som är anpassade inbyggt. I likhet med TIRF-systemet, liknande anordningar är också kommersiellt tillgängliga. Vårt system ger möjlighet att byta filter och dikroiska, så att dess användning med olika kombinationer av våglängder. Nackdelen med vårt system är det en grad av vridning som krävs för att anpassa de två bilderna. Det här problemet kan lösas med hjälp av kamera står som piezo drivs och erbjuder roterande grader av anpassning. Vi har också framgångsrikt genomfört en två kamerasystem på detta mikroskop, där kamerorna är olika och har olika pixel storlekar. Ett system som detta skulle vara bra om man behöver känslighet i en kanal och en stor dymisk intervall i en annan, vilka båda är knappt i samma kamera. Vi använde Photometrics HQ-2 kameran 2x2 binning ger oss en effektiv pixelstorlek på 12,9 m med Photometrics Quant-EM kamera som har en pixelstorlek på 16 nm. En 180 mm brännvidd röret lins användes för Quant-EM och en 145 mm brännvidd röret lins användes för HQ-2-kamera. HQ-2 kontrollerades med hjälp Metamorph programvara och Quant-EM kontrollerades via mikro-Manager på en separat dator i extern trigger läge. Den externa trigger lämnades till Quant-EM kameran med hjälp av en digital utgång av mätningen datorer DAC styrelse, som genomfördes som en ytterligare slutare i Inställningar Anpassa belysning Metamorph. Förhållandet av fokallängder hos röret linserna innehåller förhållandet av de effektiva pixelstorlekar. En representativ linje visas i figur 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit för mus-T-celler </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure Plasmiden Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> För endotoxin fria DNA-beredningar </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Anordning </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant murint IL-2 </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Mikrosfärer 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24.050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-brunn kammare täckglas </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155.409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

Signalering initieras genom T-cellreceptorn (TCR) när den är i ingrepp med antigena peptidfragment som är bundna av större histokompatibilitetskomplex (pMHC) proteiner som uttrycks på ytan av antigenpresenterande celler (APC). TCR-komplexet är sammansatt av den ligandbindande heterodimer TCRαβ som associerar icke-kovalent med CD3-dimerer (de εδ och εγ heterodimerer och ζζ homodimer) 1. Vid ingrepp av receptorn är CD3 C, kedjor fosforyleras av Src-familjen kinas, Lek. Detta leder till rekrytering av Syk-familjen kinas, Zap70, som sedan fosforyleras och aktiveras av Lek. Därefter fosforylerar Zap70 adaptern proteiner LAT och SLP76, att initiera bildandet av den proximala signalering komplex innehållande en stor mängd olika signalmolekyler 2. Bildandet av denna komplexa resulterar så småningom i kalcium-och Ras-beroende transcription faktor aktivering och därmed inleda en komplex serie program genuttryck som ger upphov till T-cell differentiering 2. TCR signaler (och den resulterande tillstånd differentiering) moduleras av många andra faktorer, inklusive antigen potens och överhörning med co-stimulatory/co-inhibitory, kemokin och cytokinreceptorer 3-4. Att studera den rumsliga och tidsmässiga organisering av den proximala signaleringen komplexet under olika stimulering förhållanden är därför nyckeln till att förstå TCR signalväg och dess förordning med signalvägar. En mycket användbart modellsystem för att studera signalering initieras av TCR vid plasmamembranet i T-celler är glas-stödda lipiddubbelskikt, såsom beskrivits tidigare 5-6. De kan användas för att presentera komplex antigena pMHC, vidhäftning och co-stimulerande molekyler till T-celler-fungerar som konstgjorda APC. Genom avbildning av T-celler interagerar medlipidbiskiktet med total inre mikroskopi reflektion fluorescens (TIRFM), kan vi begränsa excitation till inom 100 nm av utrymmet mellan glaset och cellytan 7-8. Detta tillåter oss att bilden främst de signalerande händelserna inträffar vid plasmamembranet. Eftersom vi är intresserade av avbildning rekrytering av signalering proteiner till TCR-komplexet, beskriver vi en två-kamera TIRF bildsystem där TCR, märkt med fluorescerande Fab (fragment antigenbindning) fragment av H57 antikroppen (renat från hybridom H57-597 , ATCC, ATCC nummer: kan HB-218) som är specifik för TCRp och signalering proteiner, märkta med GFP, kan avbildas samtidigt och i realtid. Denna strategi är nödvändigt på grund av den mycket dynamiska naturen hos både T-cellerna och de signaleringshändelser som sker vid TCR. Denna avbildning modalitet har gjort forskare att bilden enstaka ligander 9-11 samt rekrytering av signalmolekyler till aktiverade receptorer ochär ett utmärkt system för att studera biokemi på plats 12-16.

Watch this Scientific Journal Video about A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins at JoVE.com

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Den uppdelning av proteiner antingen inom plasmamembranet eller till intracellulära platser är en reglerande mekanism som kraftigt kan påverka signalsystem resultat, därmed att förstå signalering är det viktigt att studera den rumsliga och tidsmässiga beteendet hos de inblandade proteinerna. Vi beskriver här ett TIRF mikroskopi system för att studera signaltransduktion i T-celler, men är brett tillämpbar.

En TIRF Mikroskopi Teknik för Real-time, samtidig avbildning av TCR och dess associerade signalproteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Realtid avbildning av Leukotriene B 4 Medierad Cell Migration och BLT1 Interaktioner med β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Realtid avbildning av endotelceller-cells Junctions Under neutrofila Trans under fysiologiska Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Realtid avbildning av myeloida celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmtumörer genom Spinning Disk konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Samtidig Kvantifiering av T-cellreceptor Excision cirklar (TRECs) och K-Radering Rekombination Excision cirklar (KRECs) genom realtids-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analys av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rening av virus-DNA för identifiering av associerade Viral och cellulära proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Realtid avbildning och kvantifiering av svamp Biofilm utveckling med hjälp av en tvåfas recirkulerande flödessystem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR för rabies diagnos

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...