Name: monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Een PHS Grant (MH51393) ondersteunt dit werk. Sommige van de Aplysia we gebruiken worden door de National Resource voor Aplysia van de Universiteit van Miami in Grant RR10294 van het National Center for Research Resources, NIH.

1. Voorbereiding <ol><li> Verdoven van het dier door injectie 75-100 ml isotone magnesiumchlorideoplossing. De Aplysia we gebruiken voor de beeldvorming over het algemeen 150-200 gram en worden verkregen uit Marinus Scientific. </li><li> Speld de verdoofde dier naar een wax dekschaal. Injectienaalden werken goed voor dit doel; steriele technieken zijn niet nodig. Met behulp van de bruto pincet en standaard schaar maakt een sneetje in de voet van het dier en bloot de buccale massa. Zoek de buccale ganglion. Me...

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

We tonen technieken die kunnen worden gebruikt om gelijktijdig controleren van de intracellulaire calciumconcentratie en evalueren van de doeltreffendheid van synaptische transmissie. Deze technieken zijn bruikbaar voor het bepalen hoe de verschillende vormen van korte plasticiteit gemedieerd worden. De beeldvorming wordt uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop en CCD camera. Deze apparatuur eisen zijn relatief bescheiden in vergelijking met de meeste functionele beeldvorming set-ups. De ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> Calcium Oranje </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium kalibratiebuffer kit </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> bruikbaar voor het testen van de gevoeligheid en dynamisch bereik van het signaal </td></tr><tr><td> Magnesiumchloridehexahydraat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> in 0,33 M oplossing dier verdoven </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Testsera. <table border="1"><tbody><tr><td> Apparatuur Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> FN-1 rechtop fluorescentiemicroscoop </td><td> Nikon Instruments </td><td> met Narishige ITS-FN1 fase </td></tr><tr><td> NMN-21 manipulatoren </td><td> Narishige </td><td> gemonteerd op het podium met magneten </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD camera </td><td> Lichttechniek </td><td></td></tr><tr><td> NOS elementen AR (Versie 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> imaging software wordt gebruikt om fluorescentie gegevens te verzamelen </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor doel </td><td> Nikon Instruments </td><td> dit water immersie lens heeft een zeer lange werkafstand van 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 PC metaal halide lamp </td><td> EXFO </td><td> voor fluorescentie beeldvorming </td></tr><tr><td> LS-DWL halogeenlamp </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 filterset </td><td> Chroma Technology </td><td>; </td></tr><tr><td> Vermogen 1401 A / D converter </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> bemonstering werd gedaan op 3 kHz </td></tr><tr><td> Spike II (Versie 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> software die wordt gebruikt om gegevens te verzamelen elektrofysiologie </td></tr><tr><td> SEC-10 LX-versterker </td><td> NPI elektronica </td><td> gebruikt met een 10X headstage </td></tr><tr><td> Model 410 versterker </td><td> Brownlee precisie </td><td> gebruikt voor het amplificeren en het signaal filteren </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> minus k Technology </td><td> trillingsisolatie voor beeldvorming </td></tr><tr><td> koeling platform </td><td> op maat gemaakt </td><td> koperen plaat waardoor het ijs water wordt gepompt tegen een variabele rente </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Apparatuur die wordt gebruikt.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Er is gesuggereerd dat veranderingen in intracellulaire calcium de inductie van een aantal belangrijke vormen van synaptische plasticiteit (bijv. homosynaptic vergemakkelijking) 1 bemiddelen. Deze hypothesen worden getest door gelijktijdig monitoren van veranderingen in intracellulaire calcium en veranderingen in synaptische werkzaamheid. We zien hoe dit kan worden bereikt door het combineren calcium beeldvorming met intracellulaire opnametechnieken. Onze experimenten worden uitgevoerd in een buccale ganglion van de weekdieren Aplysia californica. Dit preparaat heeft een aantal voordelige eigenschappen experimenteel: ganglia gemakkelijk uit Aplysia en experimenten volwassen neuronen die normale synaptische verbindingen en een normale verdeling ionkanaal. Vanwege de lage stofwisseling van het dier en de relatief lage temperatuur (14-16 ° C) die natuurlijk voor Aplysia, preparaten stabiel gedurende lange tijd. ENT &quot;&gt; Om veranderingen in de intracellulaire vrije calcium zullen we de cel impermeant versie van Calcium Orange 2 die gemakkelijk &#39;geladen&#39; in een neuron via iontoforese gebruiken. detecteren Als dit lange golflengte fluorescente kleurstof bindt aan calcium, fluorescentie-intensiteit toeneemt. Calcium Orange heeft snelle kinetische eigenschappen 3 en, in tegenstelling tot ratiometrisch kleurstoffen (bijv. Fura 2), vereist geen filterwiel voor de beeldvorming. Het is vrij foto stabieler en minder fototoxische dan andere kleurstoffen (bijv. fluo-3) 2,4. Net als alle niet-ratiometrisch kleurstoffen, Calcium Orange relatieve veranderingen in calciumconcentratie aangeeft. Maar, omdat het niet mogelijk is om veranderingen in kleurstofconcentratie door laden en diffusie kan niet worden gekalibreerd absolute calciumconcentraties verschaffen. Een rechte vaste fase samengestelde microscoop werd gebruikt om beeld neuronen met een CCD camera die kan opnemen ongeveer 30 frames per seconde. In Aplysia deze temporele resolutieis meer dan voldoende om zelfs een enkele piek geïnduceerde wijziging detecteren in de intracellulaire calciumconcentratie. Sharp elektroden gelijktijdig gebruikt voor het induceren en synaptische transmissie opnemen in geïdentificeerd pre-en postsynaptische neuronen. Aan het einde van elke test, een aangepast script combineert elektrofysiologie en imaging data. Voor een goede synchronisatie te zorgen dat we gebruik maken van een lichtpuls uit een LED gemonteerd in de camera-poort van de microscoop. Manipulatie van presynaptische calcium (bijv. via intracellulaire EGTA injectie) stelt ons in staat om te testen specifieke hypotheses met betrekking tot de rol van de intracellulaire calciumconcentratie in het bemiddelen verschillende vormen van plasticiteit.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding van<em&gt; Aplysia</em&gt;. We beeld intracellulaire calcium met een fluorescerende kleurstof, Calcium Orange en induceren en synaptische transmissie controle met scherpe (intracellulair) elektroden.

Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...