Name: monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00
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Un PHS Grant (MH51393) ont soutenu ce travail. Une partie de l&#39;aplysie, nous utilisons sont fournis par le national de ressources pour l&#39;aplysie de l&#39;Université de Miami dans le cadre de la Subvention RR10294 Centre national de recherche sur les ressources, le NIH.

1. Préparation <ol><li> Anesthésier l&#39;animal en injectant 75-100 ml solution isotonique de chlorure de magnésium. L&#39;aplysie nous utilisons pour l&#39;imagerie sont généralement 150-200 grammes et sont obtenus à partir Marinus scientifique. </li><li> Pin l&#39;animal anesthésié dans un plat recouvert de cire. Aiguilles de seringues fonctionnent bien à cette fin, les techniques stériles ne sont pas nécessaires. En utilisant des pinces et ciseaux bruts standards faire une incision dans le pied...

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	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour surveiller simultanément la concentration de calcium intracellulaire et d&#39;évaluer l&#39;efficacité de la transmission synaptique. Ces techniques sont utiles pour déterminer comment les différentes formes de plasticité à court terme sont médiatisés. La formation d&#39;image est effectuée avec un microscope à fluorescence et une caméra CCD. Ces besoins en équipement sont relativement modestes par rapport à la plupa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> Calcium orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kit tampon de calcium étalonnage </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> utile pour tester la sensibilité et la gamme dynamique du signal d&#39; </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium hexahydraté </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilisé en 0.33 M de solution pour anesthésier des animaux </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Utilisé. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> FN-1 microscope droit à fluorescence </td><td> Nikon Instruments </td><td> avec Narishige ITS-FN1 étape </td></tr><tr><td> NMN-21 manipulateurs </td><td> Narishige </td><td> monté sur scène avec des aimants </td></tr><tr><td> CooISNAP HQ 2 caméra CCD </td><td> Photométrie </td><td></td></tr><tr><td> Éléments NIS AR (Version 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> logiciel d&#39;imagerie utilisé pour acquérir les données de fluorescence </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor objectif </td><td> Nikon Instruments </td><td> cette lentille à immersion de l&#39;eau a une très longue distance de travail de 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lampe aux halogénures métalliques PC </td><td> EXFO </td><td> utilisé pour l&#39;imagerie de fluorescence </td></tr><tr><td> LS-DWL Lampe halogène </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 ensemble filtre </td><td> Technologie Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> 1401 puissance convertisseur A / N </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> échantillonnage a été effectué à 3 kHz </td></tr><tr><td> Pic II (Version 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> logiciel utilisé pour acquérir des données d&#39;électrophysiologie </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificateur </td><td> NPI électronique </td><td> utilisé avec un headstage 10X </td></tr><tr><td> Modèle 410 amplificateur </td><td> Brownlee précision </td><td> utilisé pour amplifier et filtrer le signal d&#39; </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> moins k Technology </td><td> isolation des vibrations pour l&#39;imagerie </td></tr><tr><td> plate-forme de refroidissement </td><td> sur mesure </td><td> plaque en laiton à travers lequel de l&#39;eau glacée est pompée à un débit variable </td></tr></tbody></table> Tableau 2. L&#39;équipement utilisé.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Il a été suggéré que les changements dans le calcium intracellulaire médiation de l&#39;induction d&#39;un certain nombre d&#39;importantes formes de plasticité synaptique (par exemple, la facilitation homosynaptique) 1. Ces hypothèses peuvent être testées en même temps surveiller les changements dans le calcium intracellulaire et des changements dans l&#39;efficacité synaptique. Nous démontrons comment cela peut être réalisé en combinant l&#39;imagerie calcique avec les techniques d&#39;enregistrement intracellulaire. Nos expériences sont menées dans un ganglion vestibulaire du mollusque Aplysia californica. Cette préparation a un certain nombre de caractéristiques avantageuses expérimentalement: Ganglia peut être facilement retiré de l&#39;aplysie et expériences utilisent neurones adultes qui font de connexions synaptiques normales et ont une distribution normale d&#39;ions canal. En raison de la faible taux métabolique de l&#39;animal et les températures relativement basses (14-16 ° C) qui sont naturels pour l&#39;aplysie, les préparations sont stables pendant de longues périodes de temps. Calcium ent &quot;&gt; Pour détecter les changements dans le calcium intracellulaire libre, nous allons utiliser la version portable imperméant de calcium Orange 2 qui est facilement« chargé »dans un neurone par ionophorèse. Lorsque cette teinture fluorescente grande longueur d&#39;onde se lie au calcium, augmentation de l&#39;intensité de fluorescence. Orange a propriétés cinétiques rapides 3 et, contrairement aux colorants ratiométriques (par exemple, le Fura 2), ne nécessite pas de roue de filtres pour l&#39;imagerie. Il est assez photo stable et moins phototoxique que d&#39;autres colorants (par exemple, fluo-3) 2,4. Comme tous les non-ratiométrique colorants, de calcium Orange indique les changements relatifs à la concentration de calcium. Mais, car il n&#39;est pas possible de tenir compte des changements dans la concentration de colorant dues au chargement et à la diffusion, elle ne peut pas être calibré pour fournir les concentrations de calcium absolus. Une verticale, microscope fixe composé stade, a été utilisé pour les neurones d&#39;image avec une caméra CCD permet d&#39;enregistrer environ 30 images par seconde. Chez l&#39;aplysie cette résolution temporelleest plus que suffisant pour détecter même un seul pic induit par la modification de la concentration de calcium intracellulaire. Électrodes pointues sont utilisées simultanément pour induire et d&#39;enregistrer la transmission synaptique dans les neurones identifiés pré-et post-synaptiques. À la fin de chaque essai, un script personnalisé combine électrophysiologie et des données d&#39;imagerie. D&#39;assurer une bonne synchronisation on utilise une impulsion de lumière provenant d&#39;une diode montée dans l&#39;orifice de caméra du microscope. La manipulation des niveaux calciques présynaptiques (par exemple via l&#39;EGTA injection intracellulaire) nous permet de tester des hypothèses spécifiques, concernant le rôle du calcium intracellulaire dans la médiation de diverses formes de plasticité.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l&#39;efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de ganglion<em&gt; Aplysie</em&gt;. Nous l&#39;image de calcium intracellulaire à l&#39;aide d&#39;un colorant fluorescent, orange calcium, et d&#39;induire et de contrôler la transmission synaptique avec tranchants (intracellulaire) électrodes.

Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l&#39;efficacité synaptique dans le mollusque<em&gt; Aplysie</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

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