Name: monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00
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Una borsa di studio PHS (MH51393) ha sostenuto questo lavoro. Alcuni dei Aplysia usiamo sono fornite dal Risorse Nazionale per l&#39;Aplysia dell&#39;Università di Miami sotto Grant RR10294 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, NIH.

1. Preparazione <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale mediante iniezione di 75-100 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio. L&#39;Aplysia che usiamo per l&#39;imaging sono in genere 150-200 grammi e sono ottenuti da Marinus scientifico. </li><li> Pin anestetizzato l&#39;animale a un piatto coperto di cera. Aghi per siringhe funzionano bene per questo scopo; tecniche sterili non sono necessari. Utilizzo di pinze e forbici lordi standard, fare un&#39;incisione nel piede dell&#39;animale ed esporre la ma...

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Dimostriamo tecniche che possono essere utilizzati per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e di valutare l&#39;efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche sono utili per determinare in che modo le varie forme di plasticità a breve termine sono mediati. L&#39;immagine viene eseguita con un microscopio a fluorescenza e camera CCD. Questi requisiti apparecchiature sono relativamente modesta se confrontata con la maggior parte di imaging funzionale ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Calcio Arancione </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio kit di calibrazione del buffer </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> utile per testare la sensibilità e la gamma dinamica del segnale </td></tr><tr><td> Magnesio cloruro esaidrato </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilizzato in soluzione 0,33 M di anestetizzare animale </td></tr></tbody></table> Reagenti Tabella 1. Usato. <table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature Nome </td><td> Azienda </td><td> Commento </td></tr><tr><td> FN-1 microscopio a fluorescenza in posizione verticale </td><td> Nikon Instruments </td><td> con Narishige ITS-FN1 stadio </td></tr><tr><td> NMN-21 manipolatori </td><td> Narishige </td><td> montato sul palco con i magneti </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD </td><td> Fotometrici </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementi AR (Versione 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> software di imaging utilizzato per acquisire dati di fluorescenza </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor obiettivo </td><td> Nikon Instruments </td><td> questa lente immersione ha una distanza molto lunga di 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lampada ad alogenuri metallici PC </td><td> EXFO </td><td> utilizzata per l&#39;imaging di fluorescenza </td></tr><tr><td> LS-DWL lampada alogena </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 filtro set </td><td> Tecnologia Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> Potenza 1401 A / D converter </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> il campionamento è stato fatto a 3 kHz </td></tr><tr><td> Spike II (Versione 7,07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Il software utilizzato per l&#39;acquisizione dei dati di elettrofisiologia </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificatore </td><td> NPI elettronica </td><td> utilizzato con un headstage 10X </td></tr><tr><td> Modello 410 amplificatore </td><td> Brownlee di precisione </td><td> utilizzato per amplificare e filtrare il segnale </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> meno k Tecnologia </td><td> isolamento dalle vibrazioni per l&#39;imaging </td></tr><tr><td> tavolo di raffreddamento </td><td> su misura </td><td> lastra di ottone attraverso cui l&#39;acqua viene pompata ghiaccio a tasso variabile </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Attrezzatura utilizzata.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

È stato suggerito che le variazioni di calcio intracellulare mediano l&#39;induzione di un certo numero di importanti forme di plasticità sinaptica (ad esempio, facilitazione homosynaptic) 1. Queste ipotesi possono essere testati contemporaneamente seguire l&#39;evoluzione del calcio intracellulare e alterazioni in termini di efficacia sinaptica. Si dimostra come questo può essere realizzato combinando calcium imaging con tecniche di registrazione intracellulari. I nostri esperimenti sono condotti in un ganglio vestibolare del mollusco Aplysia californica. Questa preparazione ha una serie di caratteristiche vantaggiose sperimentalmente: Ganglia può essere facilmente rimosso dal Aplysia ed esperimenti utilizzare neuroni adulti che rendono normali connessioni sinaptiche e hanno una distribuzione normale canale ionico. A causa del basso tasso metabolico dell&#39;animale e le temperature relativamente basse (14-16 ° C) che sono naturali per Aplysia, preparati sono stabili per lunghi periodi di tempo. ent &quot;&gt; Per rilevare le variazioni di calcio libero intracellulare useremo la versione impermeant cella di calcio Orange 2 che è facilmente &#39;caricato&#39; in un neurone tramite ionoforesi. Quando questo colorante fluorescente lunghezza d&#39;onda lunga si lega al calcio, aumenta l&#39;intensità di fluorescenza. calcio Orange ha veloci proprietà cinetiche 3 e, a differenza di coloranti raziometrici (ad esempio, Fura 2), non necessita di ruota portafiltri per l&#39;imaging. E &#39;abbastanza stabile e meno foto fototossiche di altri coloranti (ad esempio, fluo-3) 2,4. Come tutti i non-raziometrico coloranti, calcio Arancione indica variazioni relative di concentrazione di calcio. Ma, poiché non è possibile tener conto delle variazioni concentrazione di colorante dovute al carico e diffusione, non può essere calibrato per fornire concentrazioni di calcio assoluti. Un montante, fisso stadio, microscopio composto è stato usato per i neuroni di immagine con una fotocamera CCD in grado di registrare circa 30 fotogrammi al secondo. In questo Aplysia risoluzione temporaleè più che sufficiente per rilevare anche un singolo picco alterazione indotta nella concentrazione di calcio intracellulare. Elettrodi Sharp sono contemporaneamente utilizzati per indurre e registrare la trasmissione sinaptica in neuroni identificati pre-e post-sinaptico. Al termine di ogni prova, uno script personalizzato combina elettrofisiologia e dati di imaging. Per garantire la corretta sincronizzazione usiamo un impulso di luce da un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. La manipolazione dei livelli di calcio presinaptici (ad esempio tramite iniezione intracellulare EGTA) ci permette di testare ipotesi specifiche, riguardanti il ​​ruolo del calcio intracellulare nel mediare le varie forme di plasticità.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio<em&gt; Aplysia</em&gt;. Abbiamo immagine calcio intracellulare utilizzando un colorante fluorescente, Orange calcio, e indurre e controllare la trasmissione sinaptica con taglienti (intracellulare) elettrodi.

I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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