Name: chromatin isolation by rna purification (chirp)
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Wij danken T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, en ik Shestopalov voor discussies. Ondersteund door het Agentschap van Wetenschap, Technologie en Onderzoek van Singapore (CC), NIH R01-CA118750 en R01-HG004361 (HYC), en Californië Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (HYC). HYC is een Early Career wetenschapper van het Howard Hughes Medical Institute.

1. Probe-ontwerp Ontwerp anti-sense DNA-tegels probes voor selectieve ophalen van RNA-doelwit door Chirp. <ol><li> Ontwerp anti-sense oligo-probes met behulp van de online sonde ontwerper bij <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Gebruik deze parameters: aantal sondes = 1 probe / 100 bp van RNA lengte, 2) Target GC% = 45, 3) Oligonucleotide lengte = 20; 4) Afstand lengte = 60-80. Breek RNA in segmenten als er te lang voor de ontwerper. Laat gebieden herhaalt of uitgebreide homologie. </li><li> Bestel anti-sense DNA-probes met BiotinTEG op 3-prime end. </li><li> Label probes volgens de posities langs het RNA. Scheid ze in twee zwembaden, zodat de &quot;even&quot; pool bevat alle sondes nummering 2, 4, 6, etc. en de &quot;oneven&quot; pool bevat sondes nummering 1, 3, 5, enz. verdunnen pool van de sondes op 100 uM concentratie en Bewaar bij -20 ° C. </li><li> Alle experimenten worden uitgevoerd metbeide groepen, die als interne controle elkaar. Real RNA-afhankelijke signaal aanwezig zou zijn van beide zwembaden, terwijl de probe-specifieke geluiden zou uniek zijn voor elk zwembad. Dit geldt zowel voor Chirp-qPCR en Chirp-seq. </li></ol> 2. Harvest Cellen Verzamelen cellen die worden gebruikt voor Chirp experiment. <ol><li> Groei cellen in weefselkweek platen of kolven tot confluentie. Spoel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor eens en trypsinize. Quench trypsine met&gt; 2x volume van de media, pipet op en neer naar de cellen los te maken en in enkele celsuspensie mengen. Breng alle media en geresuspendeerde cellen in 50 ml Falcon buizen. 20 miljoen cellen zijn gewoonlijk voldoende voor een Chirp monster. </li><li> Spin cellen 800RCF 4 min. Zuig media en hersuspenderen 40 miljoen cellen in 40 ml PBS, combineren buizen indien nodig. Spin cellen 800RCF 4 min. Giet PBS, zorgvuldig te zuigen op een hoek de resterende vloeistof. </li></ol&gt; 3. Cross-link Cellen en Collect celpellet Crosslink verzamelde cellen met glutaaraldehyde op RNA-chromatine interacties te bewaren en voor te bereiden celpellet. <ol><li> Voer alle stappen bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 1% glutaaraldehyde bij kamertemperatuur PBS. Doe in 10 ml per 10 miljoen cellen (0,4 ml 25% glutaaraldehyde voorraad + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyde moet worden gebruikt fris. </li><li> Tik onderkant van Falcon buizen aan pellets te verwijderen. Resuspendeer celpellet in 1% glutaaraldehyde, te beginnen met een klein volume te brokken te vermijden, dan herladen tot vol volume. Omkeren om te mengen. Crosslink 10 min. bij kamertemperatuur op een eind-tot-eind schudapparaat of rotator. </li><li> Doof het verknopingsreactie met 1/10e volume van 1,25 M glycine bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Spin op 2000RCF gedurende 5 minuten. Zuig supernatant en was pellet met 20 ml koud PBS een keer, het spinnen op 2000RCF gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig en resuspendeer de wverast, cross-linked pellet met 1 ml gekoelde PBS per 20 miljoen cellen. Breng elke ml aan een Eppendorf buis en draaien op 2000RCF gedurende 3 minuten bij 4 C. Verwijder zoveel mogelijk met PBS pipetpunt nauwkeurig. </li><li> De cel pellets in vloeibare stikstof en opslaan Flash-invriezen bij -80 ° C voor onbepaalde tijd. </li></ol> 4. Cell Lysis Lyseren verknoopt cellen cellysaat bereiden. <ol><li> Ontdooi bevroren celpellets bij kamertemperatuur. Tik op moeilijk te verjagen en meng de cel pellet. Draai beneden de pellet bij 2000RCF gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Gebruik een scherpe 10 pl pipetpunt om de resterende PBS te verwijderen. </li><li> Op een elektronische weegschaal (nauwkeurig tot op 1 mg) tarra de massa van een lege eppendorfbuisje (onze buizen wegen 1,060 gram zeer consequent). Weeg elke pellet en opnemen zijn gewicht. Een volledige 15 cm schotel van verknoopt HeLa cellen weegt meestal 100 mg. </li><li> Supplement Lysis Buffer (10x de massa van de pellet, bijvoorbeeld 1 ml voor 100 mg) met FRESh Proteaseremmer, PMSF en Superase-in (zie bijgevoegde buffer lijst). Meng goed. </li><li> Voeg 10X volume aangevuld Lysis Buffer aan elke buis en resuspendeer de pellet. Voor kleine pellets &lt;25 mg, opnieuw in suspensie in 250 ul aangevuld lysis buffer. Schorsing moet glad zijn. Zo niet, dan verdeelt de schorsing in 500 pi porties en gebruik een gemotoriseerde pellet mixer te breken bosjes. Ga onmiddellijk naar ultrasoonapparaat. </li></ol> 5. Sonicatie Shear DNA door sonicatie verknoopt cellysaten. <ol><li> Bewerk met ultrasone trillingen cellysaat in Bioruptor in 15 ml Falcon buizen. Gebruik &lt;1,5 ml lysaat in elke buis, en een snellere sonicatie niet meer dan twee buizen ultrasone trillingen per keer. </li><li> Ultrasone trillingen in een 4 ° C waterbad hoogste stand van 30 seconden, 45 seconden OFF puls intervallen. Controleer lysaat elke 30 minuten. Verder sonicatie tot het cellysaat niet meer troebel. Dit kan slechts 30 minuten en liefst 4 uur. Het aantalvan buizen, zal het monster volume, het bad temperatuur, en de periode van ultrasoonapparaat tijd invloed hebben op hoe lang het proces duurt. Buizen zal waarschijnlijk ultrasone trillingen met verschillende snelheden, dus bundelen ze samen om de 30 min en herverdelen in de originele buizen om homogeniteit te garanderen. Let op: glutaaraldehyde-verknoopt cellen nemen aanzienlijk langer aan ultrasone trillingen dan de formaldehyde-equivalenten. </li><li> Bij het lysaat duidelijk wordt, over te dragen 5 pi lysaat een nieuwe Eppendorf buis. Voeg 90 uL DNA Protease K (PK) Buffer (zie buffer lijst) en 5 ul PK. Vortex te mengen en even spin down. Incubeer 45 min bij 50 ° C. </li><li> Pak DNA met PCR Qiagen zuivering kit. Elueer DNA in 30 pi Qiagen elutiebuffer (EB) en controleer DNA grootte van 1% agarose gel. Als grootste deel van de DNA-uitstrijkje is 100-500 bp, sonicatie is voltooid. Zo niet, dan blijven ultrasone trillingen. </li><li> Centrifugeer gesoniceerd monsters 16100RCF gedurende 10 min bij 4 ° C. Combineer supernatanten, aliquot in 1 ml monsters en flash-vries in vloeibare nitrogen. Bewaren bij -80 ° C. </li></ol> 6. Chirp Hybridiseren gebiotinyleerde DNA probes om RNA te isoleren gebonden chromatine. <ol><li> Ontdooien buizen van chromatine bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid hybridisatiebuffer (zie de lijst van buffers, voor te bereiden 2 ml per ml van het chromatine). Vortex om te mengen. </li><li> Voor een typische Chirp monster door 1 ml van lysaat, verwijder dan 10 pi voor RNA-INPUT en 10 ul voor DNA-INPUT en plaats in Eppendorf buizen. Houd op het ijs tot verder gebruik. </li><li> Breng 1 ml chromatine tot 15 ml Falcon buis. Voeg 2 mL hybridisatiebuffer aan elke buis. Voor het totale volume &lt;1,5 ml, gebruik Eppendorf buizen. </li><li> Ontdooi sondes bij kamertemperatuur. NanoDrop sondes te bedragen controleren of u niet gebruikt in een lange tijd (100 uM sondes moeten spec ~ 500-600 ng / ul met behulp van enkele streng DNA-instelling). Voeg het juiste volume van de sondes aan specifieke buizen (100 pmol sonde per 1 ml chromatine, 1 pl van 100 pmol / ul sonde per 1 ml chromatine).Meng goed. Incuberen bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden. </li><li> Met 20 min resterende hybridisatie bereiden C1 magnetische kralen (bewaard bij 4 ° C). Gebruik 100 ul per 100 pmol van de sondes. Wassen met 1 ml unsupplemented Lysis Buffer drie keer, met behulp van de DynaMag-2 magneetstrip te scheiden kralen uit buffer. </li><li> Resuspendeer kralen in oorspronkelijke volume van Lysis Buffer, te vullen met verse PMSF, PI en Superase-in. Na 4 uur hybridisatie reactie voltooid worden 100 ul kralen aan elk buisje. Meng goed. Incuberen bij 37 ° C gedurende 30 min onder schudden. </li><li> Bereid Was Buffer (5 ml per monster). Vortex om te mengen. Voorverwarmen tot 37 ° C. Voeg PMSF voor gebruik. </li><li> Was kralen met 1 ml wasbuffer vijf keer. Op de eerste wasbeurt, gebruik DynaMag-15 magneetstrip om aparte kralen, giet, en resuspendeer in 1 ml wasbuffer. Breng volume 1,5 mL Eppendorf buis. Incuberen bij 37 ° C met schudden gedurende 5 minuten. </li><li> Bij volgende wasbeurten, spin down elke buis op een minicentrifuge, Stel monster op DynaMag-2 magnetische strip gedurende 1 minuut. Giet monster, veegt alle druppels met een Kimwipe, opnieuw in suspensie in 1 ml wasbuffer. Incuberen bij 37 ° C met schudden gedurende 5 minuten. Herhaal dit voor in totaal vijf wasbeurten. </li><li> Eindelijk wassen, goed mengen van de kralen. Verwijder 100 ul en zet ze opzij voor RNA isolatie. Reserve 900 ul DNA voor fractie. Plaats alle buizen op DynaMag-2 magnetische strip en verwijder wasbuffer. Draai alle buizen naar beneden kort, leg ze op de magneet strip. Volledig verwijderen van de laatste beetje wasbuffer met een scherp 10 pl pipetpunt. </li></ol> 7. RNA isolatie Uittreksel RNA fractie van Chirp monsters te kwantificeren door qRT-PCR. <ol><li> Neem 100 ul kraal monsters en 10 pl RNA INPUT monster. Voeg 85 uL RNA PK Buffer pH 7,0 tot INPUT RNA. Resuspendeer kralen in 95 ul RNA PK Buffer pH 7,0. Voeg 5 ul Proteinease K en incuberen bij 50 ° C gedurende 45 min met end-to-end schudden. </li><li> In het kort spin down alle buizen enkook monsters gedurende 10 min op verwarmingsblok bij 95 ° C. </li><li> Chill monsters op ijs, krachtig toe te voegen 500 pL TRIzol, vortex gedurende 10 sec. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Bewaren bij -80 ° C of ga naar stap 4. </li><li> Voeg 100 ul chloroform TRIzol behandelde monsters. Vortex krachtig gedurende 10 sec. Spin op 16100RCF op een benchtop centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder ~ 400 pL waterige supernatans, het vermijden van organische en interface. </li><li> Voeg 600 ul (1,5 volume) 100% ethanol en meng goed. Spin monster door MIRNeasy mini-kolommen. Was 1x met RWT (MIRNeasy mini-kit), 2x met RPE per protocol van de fabrikant. Elueren met 30 pi nuclease vrij H2O (NFH 2 O). </li><li> Behandel de RNA eluaat met DNA-free per protocol van de fabrikant. Nadat de reactie is voltooid, verwarmen van het monster gedurende 15 minuten bij 65 ° C volledig te inactiveren resterende DNase. </li><li> Gebruik 1 pl RNA isolaat per goed voor qRT-PCR analyse lncRNA te bevestigenophalen. GAPDH wordt vaak gebruikt als een negatieve controle. </li></ol> 8. DNA isolatie Uittreksel DNA-fractie van Chirp monsters te herkennen aan sequencing of door qPCR kwantificeren. <ol><li> Bereid DNA elutiebuffer (zie buffer lijst), 150 ul per monster, met inbegrip van DNA INPUT. </li><li> Voeg 1 0μL RNase A (10 mg / ml) en 10 pi RNase H (10 U / pl) per ml DNA elutiebuffer en vortex te mengen. </li><li> Resuspenderen elk monster korrels in 150 ul DNA elutiebuffer met RNAses. (Hersuspenderen DNA INPUT in 140 pi) Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min onder schudden. </li><li> Aparte kralen en supernatant op DynaMag-2 magnetische strip. Verwijder supernatant en gelabeld aan buizen. </li><li> Bereid een tweede hoeveelheid van DNA elutiebuffer met 10 pi RNase A (10 mg / ml) en RNaseH (10 U / ul) precies zoals gedaan 8.2). Voeg 150 ul aan elk monster (met inbegrip van DNA INPUT), incubeer en verwijder supernatant. Verzamel alle supernatant (schouderd te zijn ~ 300 pi). </li><li> Voeg 15 ul PK aan elk monster. Incubeer bij 50 ° C gedurende 45 min met schudden. </li><li> Pre-spin down geel phase-lock gel buizen (5PRIME). Overdracht DNA-monsters aan phase-lock gel buizen, en voeg 300 ul PhOH: Chloroform: Isoamyl per monster. Schudden gedurende 10 minuten en spin neer op een tafelmodel centrifuge bij 16100RCF gedurende 5 min bij 4 ° C. Neem waterige vanaf de top (~ 300 pi). Voeg 3 ul GlycoBlue, 30 pi NaOAc en 900 ul 100% EtOH. Meng goed en bewaar bij -20 ° C gedurende de nacht. </li><li> Spin monsters 16100RCF gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Giet supernatant voorzichtig. Voeg 1 ml 70% EtOH en vortex te mengen. Spin op 16100RCF gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet. Air drogen 1min. Resuspenderen in 30 pi EB. </li><li> DNA-monsters zijn klaar voor analyse door qPCR of het bereiden van high-throughput sequencing bibliotheken per Illumina-protocol. </li></ol> 10. Representatieve resultaten Figuur 1 </strong&gt; toont de Chirp workflow. Een succesvolle Chirp experiment verrijkt typisch significant meer doel-RNA-specifieke RNAs. Figuur 2 verrijking van de menselijke telomerase RNA (TERC) van HeLa cellen over GAPDH een overvloed van cellulaire RNA dat als een negatieve controle. De meerderheid van TERC RNA&#39;s (~ 88%) in de cel aanwezig zijn naar beneden getrokken door het uitvoeren van tjilpen, terwijl slechts 0,46% van de GAPDH RNA werd teruggehaald, aantonen dat er een verrijking factor van ~ 200 maal. Aspecifieke probes zoals probes gericht LacZ RNA, die niet wordt uitgedrukt in zoogdiercellen (figuur 2) kan worden gebruikt als additionele negatieve controles. DNA-regio&#39;s verwacht dat de doelgroep lncRNA te binden zijn meestal verrijkt over negatieve regio&#39;s, gemeten door qPCR. Figuur 3 toont qPCR validatie van vier Hotair-gebonden sites in primaire humane voorhuid fibroblasten dat we bepaald door het uitvoeren van Chirp-seq in dezelfde cel lijn, terwijl TERC en GAPDH DNA websites seRVE als negatieve controle regio&#39;s. Zowel de &quot;even&quot; en &quot;oneven&quot; probe sets leverde vergelijkbare verrijking van de verwachte Hotair-gebonden sites over negatieve regio&#39;s, een kenmerk van echte lncRNA-bindende sites. High-throughput sequencing van Chirp verrijkte DNA levert een globale kaart van lncRNA-bindingsplaatsen. De Drosophila lncRNA roX2 bekend is de X-chromosoom interactie op een wijze die nodig is voor dosering vergoeding. Figuur 4 toont roX2 bindingsprofiel over een gedeelte van het X-chromosoom. Zowel de &quot;even&quot; en &quot;oneven&quot; monsters zijn gesequenced en hun unieke geluiden zijn geëlimineerd om een ​​track van overlappende signalen te produceren. Elke &quot;piek&quot; geeft hier een sterke site van roX2 bindend. De volledige baan en de lijst van roX2 genen zijn beschreven in Chu et al.. 2011 17. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomdiagram van de Chirp proceduredure voorschrijft. Chromatine wordt verknoopt aan lncRNA: eiwitadducten in vivo Biotinylated tegelwerk probes gehybridiseerd aan lncRNA richten, en chromatine complexen worden gezuiverd met behulp van magnetische streptavidine kralen, gevolgd door strenge wasbeurten.. We elueren lncRNA gebonden DNA of eiwitten met een cocktail van RNase A en H. Een vermoedelijke lncRNA bindende sequentie wordt schematisch voorgesteld in de kleur oranje. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figuur 2. Chirp verrijkt voor menselijke TERC RNA. TERC-asDNA sondes op te halen ~ 88% van de cellulaire TERC RNA en niet op te sporen GAPDH. LacZ-asDNA probes worden gebruikt als negatieve controles en ophalen niet RNAs. De gemiddelde + sd worden weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figuur 3. Hotair Chirp-qPCR in het primair mens voorEskin fibroblasten. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 en ABCA2 zijn regio&#39;s die samenwerken met Hotair. TERC en GAPDH dienden als negatieve controles. De gemiddelde + sd worden weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figuur 4. Chirp volgende gegevens roX2 RNA in Sl2 Drosophila cellen. &quot;Even&quot; en &quot;oneven&quot; werden afzonderlijk gesequenced, hun gegevens samen te voegen tot enige gemeenschappelijke pieken weerspiegelen in beide. De samengevoegde traject wordt weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17

<ol>
	<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNAs:+insights+into+functions.">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li><li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin.">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li><li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation.">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li><li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression.">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li><li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li><li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system.">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li><li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome,+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila.">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li><li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis.">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li><li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes.">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li><li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins:+yeast+telomerase+and+beyond.">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin.">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li><li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo.">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions.">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li></ol>

C. Chu en HY Chang worden genoemd als uitvinders van een octrooiaanvraag op basis van deze methode.

Hier hebben we beschreven Chirp-seq, een methode in kaart brengen van in-vivo lncRNA bindingsplaatsen genoom-breed. De belangrijkste parameters voor succes zijn de splitsing poelen van tiling oligonucleotideprobes en glutaaraldehyde verknoping. Het ontwerp van affiniteit-probes is eenvoudig, gezien de RNA-sequentie en vereist geen voorkennis van de structuur van het RNA&#39;s of functionele domeinen. Ons succes met roX2, TERC en Hotair - drie in plaats van verschillende RNA&#39;s in twee soorten - suggereert dat Chirp-seq waarschijnlijk generaliseerbaar veel lncRNAs. Zoals met alle experimenten, zijn zorg en de juiste controles nodig zijn om de resultaten te interpreteren. Verschillende lncRNA kan titratie van omstandigheden en oordeelkundige verandering van omstandigheden, zoals selectie van verschillende affiniteit probes of verknopingsmiddelen vereisen, kunnen belichten verschillende aspecten van RNA-interacties chromatine. Net als ChIP-seq, niet alle bindende gebeurtenissen zijn noodzakelijkerwijs functioneel, en bijkomende studies nodig zijn om de biologische gevolgen van RNA-o vast te stellenccupancy op chromatine. Toch voorzien we vele interessante toepassingen van deze technologie voor onderzoekers van andere chromatine-geassocieerde lncRNAs, die nu in de duizenden 8,9. Net zoals ChIP-seq heeft de deur geopend voor genoom-brede verkenningen van DNA-eiwit interacties, kan Chirp-seq studies van de &quot;RNA interactoom&quot; onthullen vele nieuwe mogelijkheden van de biologie.

Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20&deg;C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
10 mM EDTA 
1% SDS 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 
1 mM EDTA 
0.5% SDS 
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 
1% SDS 
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
1 mM EDTA 
15% formamide (store in the dark at 4&deg;C) 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 
0.5% SDS 
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3 
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized pellet mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>V8185-904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase-in</td>
			<td>Ambion</td>
			<td><a href="http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>UCD-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (for sonication)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7626-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-01D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase H</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>R0601K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4875-100MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2302810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Ricca</td>
			<td>RSOC0020-1C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4057-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15515-026</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

Lang niet-coderende RNA&#39;s zijn belangrijke regulatoren van chromatine staten voor belangrijke biologische processen, zoals de dosering compensatie, imprinting, en ontwikkelingsstoornissen genexpressie 1,2,3,4,5,6,7. De recente ontdekking van duizenden lncRNAs in samenwerking met specifieke chromatine modificatie complexen, zoals Polycomb Repressieve Complex 2 (PRC2) die bemiddelt histon H3 lysine 27 trimethylering (H3K27me3), brede rollen voor tal van lncRNAs in het beheren van chromatine staten in een gen-specifieke suggereert mode 8,9. Terwijl sommige lncRNAs worden verondersteld om te werken in cis op naburige genen, andere lncRNAs werken in trans naar de verte gelegen genen reguleren. Bijvoorbeeld, Drosophila lncRNAs roX1 en roX2 binden tal van regio&#39;s op het X-chromosoom van mannelijke cellen, en zijn van cruciaal belang voor de dosering compensatie 10,11. Echter, de exacte locaties van hun bindingsplaatsen niet bekend met een hoge resolutie. Ook de menselijke lncRNA Hotair kan PRC2 bezetting van invloed zijn op hundreds van genen genoom-brede 3,12,13, maar hoe specificiteit wordt bereikt, is onduidelijk. LncRNAs kan ook dienen als modulaire steigers voor de samenstelling van verschillende eiwitcomplexen te werven. De klassieke trans-werkende RNA-steiger is de TERC RNA dat dient als de sjabloon en steiger voor het telomerase complex 14; Hotair kan ook dienen als een platform voor PRC2 en een H3K4 demethylase complex 13. Eerdere studies mapping RNA bezettingsgraad van chromatine gebleken aanzienlijke inzichten 15,16, maar alleen op een locus met genen voor een. De bezettingsgraad sites van de meeste lncRNAs zijn niet bekend, en de rollen van lncRNAs in chromatine verordening zijn vooral afgeleid uit de indirecte effecten van de lncRNA verstoring. Net zoals chromatine immunoprecipitatie gevolgd door middel van microarray of diep-sequencing (chip-chip of chip-seq, respectievelijk) is sterk ons ​​begrip van eiwit-DNA interacties op een genomische schaal verbeterd, hier hebben we illustreren een recentgevoerd gepubliceerde strategie op de lange RNA genoom-brede bezetting in kaart te brengen met een hoge resolutie 17. Deze methode, chromatine Isolatie van RNA-zuivering (Chirp) (figuur 1), is gebaseerd op affiniteit vangst van de beoogde lncRNA: chromatine complex door tegels antisense-oligo&#39;s, die vervolgens een kaart van genomische bindingsplaatsen genereert met een resolutie van enkele honderden bases met hoge gevoeligheid en weinig achtergrond. Chirp is voor vele lncRNAs omdat het ontwerp van affiniteit-probes is eenvoudig aangezien de RNA sequentie en vereist geen kennis van de structuur van de RNA of functionele domeinen.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chirp is een nieuwe en snelle techniek om genomische bindingsplaatsen van niet-coderende RNA&#39;s lang (lncRNAs) in kaart te brengen. De methode maakt gebruik van de specificiteit van anti-sense oligonucleotiden tegels aan de lijst van lncRNA-gebonden genomische locaties mogelijk te maken.

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...