Name: purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health und der Mukoviszidose-Stiftung unterstützt.

1. Vorbereitung der Bakterien für die LPS-Extraktion <ol><li> Starten Sie eine Übernachtkultur in 5 ml Luria Broth (LB), die mit Antibiotika bei Bedarf ergänzt. Kultur wachsen über Nacht (12-18 Stunden) in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis 1:10 mit LB und nehmen eine OD 600 Lektüre in einem Spektralphotometer. Basierend auf der OD 600 Lektüre, machen Sie eine 1,5 ml Suspension aus Ihrem Bakterien auf eine ...

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	<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+endotoxins.">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li><li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+O-specific+lipopolysaccharide.">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li><li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide:+a+major+virulence+factor,+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li><li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection:+LPS,+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li><li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli.">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).</li><li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1:K20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing.">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li><li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis:+a+class+of+serum-sensitive,+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains.">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li><li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li><li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li><li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharides.">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).</li><li>Lieberman, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+ties+novel+genes+to+pathogenesis.">Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis.</a> Nat Genet. , (2011).</li></ol>

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von LPS von anderen zellulären Komponenten, einschließlich Nukleinsäuren und Proteinen beschrieben. Diese Methode bietet eine hohe Qualität LPS, die in einer Reihe von verschiedenen Visualisierungsmethoden, einschließlich des Kohlenhydrat-Färbung der SDS-PAGE-Gelen, wie in 1 gezeigt ist, verwendet werden kann. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um LPS aus einer Vielzahl von Stämmen Serotyp, unter Verwendung spezifischer Antiseren, oder um eine Verwandtschaft zwischen den...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DNase I rekombinanten, RNase-frei </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Fischer </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-gesättigtem Phenol </td><td> Fischer </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Smaragd 300 Lipopolysaccharid Gel Stain Kit </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein wichtiger Bestandteil von Gram-negativen bakteriellen äußeren Membranen. Es ist eine dreigliedrige Molekül, das aus Lipid A, das in der äußeren Membran eingebettet ist, ein Kern-Oligosaccharid und Wiederholen der O-Antigen-Einheiten, die nach außen erstrecken sich von der Oberfläche der Zelle 1, 2. LPS ist ein Molekül, das immundominante wichtig für die Virulenz und Pathogenese vieler Bakterienarten, darunter Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-Arten, und Escherichia coli 3-5, und Unterschiede in der LPS O-Antigen-Zusammensetzung bilden die Grundlage für die Serotypisierung der Stämme. LPS wird in Anlage beteiligten Zellen zu Beginn der Infektion Host und bietet Schutz vor Komplement-vermittelte Tötung; Stämme, die LPS fehlt, gedämpft werden kann für die Virulenz 6-8. Aus diesen Gründen ist es wichtig, LPS visualisieren, insbesondere aus klinischen Isolaten. Visualisierung von LPS Bandenmuster und Erkennung durch spezifische einntibodies können nützliche Werkzeuge sein, um Stamm-Linien zu identifizieren und verschiedenen Mutanten zu charakterisieren. In diesem Bericht beschreiben wir eine heiße wässrige Phenol-Verfahren zur Isolierung und Reinigung von LPS aus Gram-negativen bakteriellen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Extraktion von LPS von Nukleinsäuren und Proteinen, die mit Visualisierung von LPS, die mit kürzeren, weniger intensiv Extraktionsverfahren 9 erfolgt stören können. LPS diese Weise hergestellten durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und gefärbt direkt unter Verwendung von Kohlenhydrat / Glykoprotein Flecken oder Standard-Silberfärbung Verfahren getrennt werden können. Viele Anti-Seren gegen LPS Antikörper enthalten, dass mit der äußeren Membran-Proteine ​​oder andere antigene Ziele, kann ein Hindernis für kreuzreagieren Reaktivität nach Western-Immunoblot-SDS-PAGE getrennt Zelllysat beobachtet. Protease-Behandlung von Zelllysat allein ist nicht immer ein wirksames Mittel zur Beseitigung dieserHintergrund der Nutzung dieser oder andere Visualisierungs-Methoden. Ferner kann umfangreiche Proteasebehandlung in einem Versuch, dieses Objekt zu entfernen, schlechter Qualität LPS, die nicht gut von einem der vorgenannten Verfahren gelöst führen. Aus diesen Gründen glauben wir, dass das folgende Protokoll, aus Westpahl Jann und 10 angepasst, ideal für die LPS-Extraktion ist.

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Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Wir beschreiben ein modifiziertes heißen wässrigen-Phenolextraktion Verfahren zum Reinigen von Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen Bakterien. Sobald extrahiert wurden, kann die LPS anschließend durch SDS-PAGE analysiert und visualisiert werden durch direkte Färbung oder Western-Immunoblot-.

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Forschung

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Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

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A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

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Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

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Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

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