Name: purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00
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この作品は、健康と嚢胞性線維症財団の国立研究所からの補助金によってサポートされていました。

1。 LPS抽出のための細菌の調製<ol><li>必要に応じて抗生物質を補充したルリア培地（LB）、5mlに一晩培養を開始します。 °C、200 rpmは37℃で振盪インキュベーターで一晩培養し（12-18時間）に成長。 </li><li> LBで培養1:10に希釈し、分光光度計でOD 600値を読み取ります。 OD 600が読みに基づいて、0.5のOD 600に細菌の1.5 mLの懸濁液を作る。 </li><li>ペレットを10分間10600×g</em...

<ol>
	<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+endotoxins.">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li><li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+O-specific+lipopolysaccharide.">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li><li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide:+a+major+virulence+factor,+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li><li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection:+LPS,+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li><li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli.">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).</li><li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1:K20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing.">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li><li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis:+a+class+of+serum-sensitive,+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains.">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li><li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li><li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li><li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharides.">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).</li><li>Lieberman, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+ties+novel+genes+to+pathogenesis.">Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis.</a> Nat Genet. , (2011).</li></ol>

我々は、核酸やタンパク質を含む他の細胞成分から、LPSを離れて精製する方法を説明してきました。このメソッドは、図1に示すように、SDS-PAGEゲルの炭水化物染色など、さまざまな可視化手法、数で使用することができる高品質のLPSを提供しています。このメソッドは、特定の抗血清を使用して、株の様々なLPSの血清型に、または直接可視化による分離株の間に関連性を示すために使用する?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DNase Iを組換え、RNaseフリー</td><td>ロシュ社</td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>ロシュ社</td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>フィッシャー</td><td> BP1700 </td></tr><tr><td>フェノールトリス飽和</td><td>フィッシャー</td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>トーマス科学</td><td> C313K31 </td></tr><tr><td>プロQエメラルド300リポ多糖ゲル染色キット</td><td>分子プローブ</td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction

リポポリサッカライド（LPS）はグラム陰性細菌の外膜の主要成分である。それは外側の膜に埋め込 ​​まれている、セル1、2の表面から外側に延びるコア糖鎖とO-抗原繰り返し単位脂質から成る三分子である。 LPSは、 緑膿菌、サルモネラ属、 大腸菌 3月5日を含む多くの細菌種の病原性と病原性に重要である免疫分子であり、LPS O抗原組成の違いは、株の血清型の基礎を形成する。 LPSは、感染の開始時に宿主細胞に付着に関与しており、補体媒介性の殺害からの保護を提供されています。LPSを欠いている株は病原性6-8減衰させることができる。これらの理由から、特に臨床分離株から、LPSを可視化することが重要です。具体的なパターンとの認識をバンディングの可視化LPSntibodiesは、ひずみの系統を識別するために、様々な変異体を特徴づけるために有用なツールにすることができます。 本稿では、グラム陰性細菌の細胞からのLPSの単離および精製のためのホット水 - フェノール法を説明します。このプロトコルは、距離が短く、より集中的な抽出方法9で発生したLPSの可視化を妨げる可能性核酸とタンパク質からLPSの抽出が可能になります。 LPSは、この方法は糖鎖/糖タンパク質汚れや標準の銀染色法を用いたドデシル硫酸ナトリウム（SDS） - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）と直接に染色されたで区切ることができます用意しました。 LPSには多くの抗血清では反応性を妨げることができる外膜タンパク質または他の抗原ターゲットと交差反応する抗体を含むSDS-PAGEで区切られた粗細胞溶解物のウエスタンブロット後に観察した。単独で粗細胞溶解物のプロテアーゼ処理は、常にこの除去の効果的な方法ではありませんこのまたは他の可視化方法を使用して背景。さらに、このような背景を削除しようとの広範なプロテアーゼ処理も、上述のいずれかの方法によって解決されていない低品質のLPSにつながる可能性があります。これらの理由から、我々はWestpahlとジャン10から適応し、次のプロトコルは、LPSの抽出のための理想的であると信じています。

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Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

私たちは、グラム陰性菌からリポ多糖（LPS）を浄化するための変更されたホット水 - フェノール抽出法について説明します。一度抽出し、LPSは、その後、SDS-PAGEで分析し、直接染色またはウェスタンブロットによって可視化することができます。

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

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