Name: purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health og Cystisk fibrose Foundation.

1. Utarbeidelse av bakterier for LPS Extraction <ol><li> Begynn en overnatting kultur i 5 ml Luria buljong (LB), supplert med antibiotika hvis nødvendig. Grow kultur natten (12-18 timer) i en rystelse inkubator ved 37 ° C og 200 rpm. </li><li> Fortynn kulturen 01:10 med LB og ta en OD 600 lesing i et spektrofotometer. Basert på OD 600 lesing, foreta en 1,5 ml suspensjon av bakterier til en OD 600 på 0,5. </li><li> Pellet bakterier i en mikrosentrifuge på 10 600 x gi 10 mi...

<ol>
	<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+endotoxins.">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li><li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+O-specific+lipopolysaccharide.">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li><li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide:+a+major+virulence+factor,+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li><li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection:+LPS,+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li><li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli.">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).</li><li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1:K20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing.">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li><li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis:+a+class+of+serum-sensitive,+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains.">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li><li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li><li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li><li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharides.">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).</li><li>Lieberman, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+ties+novel+genes+to+pathogenesis.">Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis.</a> Nat Genet. , (2011).</li></ol>

Vi har beskrevet en metode for rensing LPS unna andre cellulære komponenter, inkludert nukleinsyrer og proteiner. Denne metoden gir høy kvalitet LPS som kan brukes i en rekke ulike visualisering metoder, inkludert karbohydrat farging av SDS-PAGE geler, som vist i Figur 1. Denne metoden kan brukes til å serotype LPS fra en rekke stammer, med bestemte anti-sera, eller å vise slektskap mellom isolatene ved direkte visualisering. For eksempel, en fersk genom-wide sekvensering prosjekt i kombinasjon med LPS karakteriseri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DNase jeg rekombinant, RNase-fritt </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Fisher </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-mettet Phenol </td><td> Fisher </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Dietyleter </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 lipopolysakkarid Gel Stain Kit </td><td> Molekylære prober </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction

Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig komponent av Gram-negative bakterielle ytre membranene. Det er en tredelt molekyl som består av lipid A, som er innebygd i den ytre membranen, en kjerne oligosakkarid og repeterende O-antigen enheter som strekker seg utover fra overflaten av cellen 1, 2. LPS er en immunodominant molekyl som er viktig for virulens og patogenese av mange bakteriearter, inkludert Pseudomonas aeruginosa, Salmonella arter, og Escherichia coli 3-5, og forskjeller i LPS O-antigen sammensetning danner grunnlaget for serotyping stammer. LPS er involvert i vedlegg til vertsceller ved initiering av smitte og gir beskyttelse mot komplement-mediert drap, stammer som mangler LPS kan dempes for virulens 6-8. Av disse grunner er det viktig å visualisere LPS, spesielt fra kliniske isolater. Visualisere LPS banding mønstre og anerkjennelse ved spesifikk enntibodies kan være nyttige verktøy for å identifisere belastningsskader linjene og å karakterisere ulike mutanter. I denne rapporten beskriver vi en varm vandig-fenol metode for isolering og rensing av LPS fra Gram-negative bakterielle celler. Denne protokollen tillater utvinning av LPS unna nukleinsyrer og proteiner som kan forstyrre visualisering av LPS som skjer med kortere, mindre intensive hentingsmetodene 9. LPS forberedt på denne måten kan skilles ved natrium dodecyl sulfat (SDS)-polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) og direkte beiset med karbohydrater / glykoprotein flekker eller standard sølv flekker metoder. Mange anti-sera til LPS inneholde antistoffer som kryssreagerer med ytre membran proteiner eller andre antigene mål som kan hindre reaktivitet observert etter Western immunoblot av SDS-PAGE-skilt råolje celle lysates. Protease behandling av råolje celle lysates alene er ikke alltid en effektiv måte å fjerne dettebakgrunn bruker denne eller andre visualisering metoder. Videre kan utstrakt protease behandling i et forsøk på å fjerne denne bakgrunn føre til dårlig kvalitet LPS som ikke er godt løst av noen av de nevnte metodene. Av disse grunner, mener vi at følgende protokoll, tilpasset fra Westpahl og Jann 10, er ideelt for LPS utvinning.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction at JoVE.com

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Vi beskriver en modifisert hot vandig-fenol utvinning metode for rensing av lipopolysakkarid (LPS) fra Gram-negative bakterier. Når utvinnes, kan LPS bli senere analyseres av SDS-PAGE og visualisert ved direkte farging eller vestlig immunoblot.

Rensing og Visualisering av lipopolysakkarid fra Gram-negative bakterier ved Hot Vandig-fenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex Protocol for DNA-ekstraksjon fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp..

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rensing av Patogen vakuoler fra<em&gt; Legionella</em&gt;-Infiserte fagocytter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

En metode for generering av Lunge neutrofili Bruke aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T celler Capture Bakterier av Transinfection fra dendrittiske celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bestemmelse av Biofilm Initiation på virusinfiserte celler av bakterier og sopp

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Utvinning av Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobielle infeksjoner og analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...