Name: purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и кистозный фиброз фонда.

1. Подготовка бактерий для добычи LPS <ol><li> Начать ночной культуры в 5 мл бульона Лурия (LB), дополненная антибиотиками, если необходимо. Рост культуры ночь (12-18 часов) в дрожащей инкубаторе при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту. </li><li> Развести культуры 1:10 LB и принимают OD 600 чтение в ...

<ol>
	<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+endotoxins.">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li><li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+O-specific+lipopolysaccharide.">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li><li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide:+a+major+virulence+factor,+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li><li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection:+LPS,+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li><li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli.">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).</li><li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1:K20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing.">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li><li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis:+a+class+of+serum-sensitive,+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains.">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li><li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li><li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li><li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharides.">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).</li><li>Lieberman, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+ties+novel+genes+to+pathogenesis.">Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis.</a> Nat Genet. , (2011).</li></ol>

Мы описали способ очистки LPS от других клеточных компонентов, включая нуклеиновые кислоты и белки. Этот метод обеспечивает высокое качество ЛПС, которые могут использоваться в целом ряде различных методов визуализации, в том числе углеводный окрашивания SDS-PAGE гелей, как показано на рис...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> ДНКазы I рекомбинантный, РНКазы бесплатно </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> РНКазы </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Протеиназы K </td><td> Рыбак </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Трис-насыщенные фенола </td><td> Рыбак </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Диэтиловый эфир </td><td> Томас Научно </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 липополисахарида гель пятна Kit </td><td> Молекулярные зонды </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction

Липополисахарида (ЛПС) является основным компонентом грамотрицательных бактериальных внешней оболочки. Это трехстороннее молекула, состоящая из липидного, который встроен в наружную оболочку, олигосахарид кора и повторяющиеся О-антиген единиц, которые выходят наружу от поверхности клетки 1, 2. LPS является иммунодоминантных молекула, которая имеет важное значение для вирулентности и патогенезе многих видов бактерий, в том числе синегнойной палочки, сальмонелл видов, и кишечная палочка 3-5, и различия в LPS О-антиген состава составляют основу для серотипирования штаммов. LPS участвует в приложении к клеткам хозяина в начале инфекции и обеспечивает защиту от комплемент-опосредованной убийство; штаммы, которые не имеют ЛПС может быть ослаблен на вирулентность 6-8. По этим причинам, важно, чтобы визуализировать ЛПС, в частности, от клинических изолятов. Визуализация LPS бэндинга и признание конкретныхntibodies могут быть полезными инструментами для выявления штамма линий и охарактеризовать различные мутанты. В этом докладе мы описываем горячего водного фенола метод выделения и очистки от ЛПС грам-отрицательных бактерий. Этот протокол позволяет по добыче ЛПС от нуклеиновых кислот и белков, которые могут препятствовать визуализации LPS, что происходит с более короткими, менее интенсивными методами добычи 9. LPS подготовлена ​​таким образом, могут быть разделены додецилсульфата натрия (SDS), электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и непосредственно окрашенных использование углеводов / гликопротеин пятна или стандартных методов окрашивания серебром. Многие анти-сывороток LPS содержат антитела, которые перекрестно реагируют с внешней мембранных белков или других целей антигенного, которые могут помешать реактивности наблюдаются следующие Западной иммуноблота в SDS-PAGE разделенных сырой лизатов клеток. Протеазы лечение сырой лизатов клетки сами по себе не всегда является эффективным способом устранения этогофоновом режиме, используя эту или другие методы визуализации. Кроме того, интенсивное лечение протеазы в попытках удалить этот фон может привести к ухудшению качества LPS, что не очень хорошо решить ни одной из вышеупомянутых методов. По этим причинам мы считаем, что следующий протокол, адаптированный Westpahl и Янн 10, идеально подходит для извлечения ЛПС.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction at JoVE.com

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Мы описываем изменение горячей водно-фенольной экстракции способ очистки липополисахарида (ЛПС) из грам-отрицательных бактерий. После извлечения, ЛПС может быть в дальнейшем проанализированы SDS-PAGE и визуализировать прямого окрашивания или Западной иммуноблота.

Очистка и визуализация липополисахарида из грамотрицательных бактерий горячих водно-фенольной экстракции

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

IgY Технология: Добыча Куриный Антитела из яичного желтка на полиэтиленгликоля (ПЭГ) осадков

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Очистка Возбудитель вакуоли с<em&gt; Legionella</em&gt;-Инфицированных Фагоциты

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Способ генерации легких нейтрофилия Использование аэрозольного липосахарид

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Т-клеток Захват бактерий Transinfection от дендритных клеток

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Определение биопленки инициации на инфицированные вирусом клетки с помощью бактерий и грибов

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...