Name: identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Florida Centrum för hjärntumör Research, Preston A. Wells Jr Centrum för hjärntumör Terapi och National Institutes of Health (1R21CA141020-01).

1. Förbereda Glioblastom enkelcellsuspension <ol><li> Gliomasphere kultur etableras och upprätthålls med hjälp av neurosfären analysen (NSA) som tidigare beskrivits 2,11,12. </li><li> Vid lämplig tidpunkt för passage av gliomaspheres, mediet innehållande sfärerna avlägsnas, placeras i en lämplig storlek sterilt vävnadsodlings rör och centrifugerades vid 800 rpm (110 g) under 5 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Supernatanten kastas och pelleten av sfärer återsuspenderas i 1 ml 0,05% trypsi...

<ol>
	<li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability.">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li><li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide.">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li><li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth.">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li><li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma.">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li><li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive,+quiescent,+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro.">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li><li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3.">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

Ett ökande antal studier har visat hur viktigt det är en långsamt dela underavdelning av celler i cancer som bidrar till tumörbildning och behandling motstånd 2-8. Därför är det viktigt att beskriva och standardisera experimentella metoder som gör det möjligt att studera denna specifika subpopulation av celler eller mer allmänt att jämföra subpopulationer med olika tillväxttakt. Använda CFSE att identifiera och isolera undergrupper fraktioner av celler baserat på deras hastighet av celldelning...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Typ </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05.750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC spridning Kosttillskott (Human) </td><td> Mediumsupplement </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05.753 </td></tr><tr><td> % 0,05 trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Sojaböntrypsininhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 kolv </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136.196 </td></tr><tr><td> T80 kolv </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178.905 </td></tr><tr><td> 15 ml rör </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352.096 </td></tr><tr><td> 50 ml rör </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352.070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Tillväxtfaktor </td><td> FoU </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace CFSE cellproliferation Kit </td><td> Fluorescerande celldelning Tracking Dye </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

Tumör heterogenitet är en grundläggande funktion som stöder tumör robusthet och presenterar en central hinder för utvecklingen av terapeutiska strategier 1. För att övervinna problemet med tumören heterogenitet, är det viktigt att utveckla analyser och verktyg som gör det möjligt fenotypisk (EPI) genetisk och funktionell identifiering och karakterisering av tumör subpopulationer som driver specifika sjukdomar sjukdomar och representerar kliniskt relevanta mål. Det är nu väl fastställt att tumörer uppvisar distinkta sub-fraktioner av celler med olika frekvenser av celldelning, och att de funktionella kriterierna för att vara långsam cykling positivt associerad med tumörbildning förmåga i flera cancerformer inklusive de av hjärnan, bröst, hud och pankreas samt leukemi 2-8. Det fluorescerande färgämnet karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) har använts för att spåra frekvensen delning av celler in vitro och in vivo i blodburen tumors och solida tumörer, såsom glioblastom 2,7,8. Cellen-genomträngande icke-fluorescerande pro-drug CFSE omvandlas genom intracellulära esteraser till en fluorescerande förening, som kvarhålles inuti celler genom kovalent bindning till proteiner genom reaktion av dess succinimidyl grupp med intracellulära amingrupper för att bilda stabila amidbindningar 9. Den fluorescerande färgämne är jämnt fördelad mellan dotterceller vid divisioner, vilket leder till en halvering av fluorescensintensiteten med varje celldelning. Detta möjliggör spårning av cellcykeln frekvens upp till 8-10 omgångar division 10. CFSE retentionskapacitet användes med celler hjärntumör att identifiera och isolera en långsam cykling underpopulation (topp 5% färgämne kvarhållande celler) visade att anrikas i cancer stamceller aktivitet 2. Detta protokoll beskriver tekniken för färgning celler med CFSE och isolering av enskilda populationer inom en kultur av humant glioblastoma (GBM)-härledda celler som har olika division priser med flödescytometri 2. Tekniken har tjänat till att identifiera och isolera en hjärntumör långsam cykling population av celler på grund av deras förmåga att behålla CFSE märkning.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE at JoVE.com

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Denna video protokoll demonstrerar tillämpningen av det fluorescerande färgämnet karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) för identifiering och separering av olika delpopulationer av celler i människans glioblastom baserade på frekvensen av celldelning.

Identifiering och isolering av långsamt delande celler i humant glioblastom Använda karboxifluorescein succinimidylester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generation Microtumors Använda 3D Human Biogel odlingssystemet och patientgenererade glioblastomceller för Kinomic Profilering och läkemedelssvar Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

Intranasal leverans av terapeutiska stamceller till glioblastom i en musmodell

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering av immunceller i mänsklig fettvävnad med hjälp av flödescytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primära mänskliga Decidual celler från foster hinnor av termen efterbörd

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...