Name: a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example at JoVE.com

De auteurs danken de medewerkers van de afdeling Farmaceutische Biotechnologie en Moleculaire Biologie en in het bijzonder Monique De Pelsmacker voor de voorbereiding van de radioactief gemerkte virus. We zijn dankbaar voor Ellen Merckx en Hadewych Halewyck voor hun interessante opmerkingen en discussies en aan Gerrit De Bleeser voor zijn hulp in het lab. Dit werk werd financieel ondersteund door een OZR toekenning van de Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) en de World Health Organization (TSA 200.410.791). Lise Schotte is een predoctorale fellow van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).

Het principe (A) en een overzicht van de werkwijze (B) worden weergegeven in Figuur 1. 1. Voorbereiding van de buffer <ol><li> Bereid Binding / wasbuffer door oplossen natriumdiwaterstoffosfaat (50 mM) en natriumchloride (300 mM) in water en de pH tot 8,0. Daarnaast voegen Tween 20 (0,01% (m / v) eindconcentratie), methionine (2% (m / v) eindconcentratie) en albumine (0,1% (m / v) eindconcentratie) en aan te passen aan het gewenste volume. </li></ol> ...

<ol>
	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

In het protocol wordt de radioactiviteit van het antigeen interactie met de nanobody gedefinieerd als het verlies van radiogelabelde virus uit de supernatant. Daarom is de hoeveelheid neergeslagen radioactiviteit (= 100 - a%) (gebonden aan de magnetische korrels) worden geschat op een indirecte wijze de radioactiviteit in het supernatant (= a%). Anderzijds is het ook mogelijk om de radioactiviteit van het neergeslagen gebonden fractie van antigen te meten op directe wijze door elutie de immunocomplexen van de magnetisch...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Naam van het serum</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogus nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-tag Isolatie en Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Magnetische kralen</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;HiSafe&#39; 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; Scintillatievloeistof</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Op voorwaarde dat een eiwit kan worden gelabeld en een ander eiwit gelabeld, kan deze methode worden toegepast voor het onderzoek van eiwit-eiwit interacties. Het is gebaseerd op enerzijds op het inzicht gemerkte eiwit door kobalt beklede magnetische kralen en anderzijds op de interactie tussen het gelabelde eiwit en een tweede specifieke eiwit dat wordt aangeduid. Eerst worden de etiketten en gemerkte eiwitten gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur. De magnetische kralen, dat het label herkennen toegevoegd en de gebonden fractie van gemerkt eiwit wordt gescheiden van de ongebonden fractie met magneten. De hoeveelheid gemerkte eiwitten die opgenomen kan worden bepaald op indirecte wijze door meting van het signaal van de gemerkte eiwitten bleven in de ongebonden fractie. De beschreven vloeibare fase affiniteit test is zeer nuttig wanneer conformationele conversie gevoelige eiwitten zijn kontAyed. De ontwikkeling en toepassing van de test is aangetoond voor de interactie tussen poliovirus en het poliovirus herkennen van nanobodies 1. Aangezien poliovirus gevoelig conformationele conversie 2 wanneer gehecht aan een vaste ondergrond (ongepubliceerde resultaten), is het gebruik van ELISA beperkt en een vloeistoffase systeem derhalve de voorkeur. Een voorbeeld van een vloeibare fase systeem vaak gebruikt in polioresearch 3,4 de micro proteïne-A-immunoprecipitatie test 5. Hoewel deze test heeft bewezen de toepasbaarheid, het vereist een Fc-structuur, die afwezig is in de nanobodies 6,7. Echter, zoals een andere mogelijkheid, kunnen deze interessante en stabiele enkel-domein antilichamen 8 gemakkelijk worden gemanipuleerd met verschillende tags. De gebruikte (His) 6-tag affiniteit voor tweewaardige ionen zoals nikkel of kobalt, die gemakkelijk op hun beurt worden aangebracht op magnetische korrels toont. Hiervoor werden deze eenvoudige kwantitatieveaffiniteit capture assay op basis van kobalt gecoate magnetische kralen. Poliovirus werd gelabeld met 35 S om ongehinderd interactie met de Nanobodies mogelijk te maken en een kwantitatieve detectie mogelijk. De methode is eenvoudig uit te voeren en kunnen worden tegen lage kosten, die verder wordt ondersteund door de mogelijkheid effectief regenereren van de magnetische korrels.

Watch this Scientific Journal Video about A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example at JoVE.com

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...