Name: a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00
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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Pharmazeutische Biotechnologie und Molekularbiologie und insbesondere Monique de Pelsmacker für die Herstellung der radioaktiv markierten Virus. Wir bedanken uns bei Ellen Merckx und Hadewych Halewyck für ihre interessanten Ausführungen und Diskussionen und Gerrit de Bleeser für seine Hilfe im Labor. Diese Arbeit wurde finanziell durch eine OZR Gewährung der Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), dem Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (G.0168.10N) und der Weltgesundheitsorganisation (TSA 200410791) unterstützt. Lise Schotte ist ein Promotionsstipendium des Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (FWO).

Das Prinzip (A) und ein Überblick über die Verfahren (B) sind in 1 dargestellt. 1. Vorbereitung der Puffer <ol><li> Bereiten Binding / Waschpuffer durch Auflösen von Natriumdihydrogenphosphat (50 mM) und Natriumchlorid (300 mM) in Wasser und den pH-Wert auf 8,0. Zusätzlich fügen Tween 20 (0,01% (m / v) Endkonzentration), Methionin (2% (m / v) Endkonzentration) und Albumin (0,1% (m / v) Endkonzentration) und stellen Sie die gewünschte Lautstärke ein. </li></ol><p cla...

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	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

In dem Protokoll wird die Radioaktivität des Antigens Interaktion mit dem Nanobody als Verlust von radioaktiv markiertem Virus aus dem Überstand definiert. Daher ist die Menge des ausgefällten Radioaktivität (= 100 - a%) (gebunden an die magnetischen Beads) in einer indirekten Weise durch die Radioaktivität im Überstand (= a%) geschätzt werden. Auf der anderen Seite ist es auch möglich, die Radioaktivität des gebundenen Fraktion ausgefallene von Antigen in direkter Weise durch Elution der Immunkomplexe von den ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenzes</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-Tag Isolierung und Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Magnetic Beads</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;Hisafe&#39; 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; Szintillationsflüssigkeit</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Vorausgesetzt, dass ein Protein markiert werden kann und ein anderes Protein markiert, kann dieses Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durchgeführt werden. Es wird einerseits auf der Erkenntnis des markierten Proteins durch Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen und auf der anderen Seite auf der Wechselwirkung zwischen dem markierten Proteins und einer zweiten spezifischen Protein, das markiert ist bezogen. Zuerst werden die markierten und markierte Proteine ​​gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die magnetischen Perlen, die das Tag zu erkennen, werden zugegeben und der Anteil an gebundenem markierte Protein wird aus der ungebundenen Fraktion mit Hilfe von Magneten getrennt. Die Menge an markiertem Protein, das erfasst werden auf eine indirekte Weise durch Messen des Signals des markierten Proteins blieb in der ungebundenen Fraktion bestimmt werden. Die beschriebene flüssige Phase Affinitätsassay ist extrem nützlich, wenn Konformationsänderung Umwandlung empfindliche Proteine ​​Esel sindAyed. Die Entwicklung und Anwendung des Tests ist für die Interaktion zwischen Poliovirus und Poliovirus erkennen Nanobodies 1 demonstriert. Da Poliovirus ist empfindlich gegenüber Konformationskonversion 2, wenn an einer festen Oberfläche (unveröffentlichte Ergebnisse) befestigt ist, ist die Verwendung von ELISA begrenzt und eine flüssige Phase System sollten bevorzugt werden. Ein Beispiel einer flüssigen Phase System auch an den polioresearch 3,4 verwendet wird, ist die Mikro-Protein A-Immunpräzipitation Test 5. Auch wenn dieser Test seine Anwendbarkeit unter Beweis gestellt hat, bedarf es eines Fc-Struktur, die es in den Nanobodies 6,7 ist. Doch als eine weitere Gelegenheit, lassen sich diese interessante und stabile Single-Domain-Antikörper 8 leicht mit verschiedenen Tags konstruiert werden. Die weit verbreitete (His) 6-Tag Affinität für zweiwertige Ionen, wie Nickel oder Kobalt, das an der Reihe leicht auf magnetischen Kügelchen beschichtet sein zeigt. Wir haben deshalb diese einfache quantitativeAffinität Capture-Assay auf Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen basiert. Poliovirus wurde mit 35 S markiert, um ungehinderten Interaktion mit den Nanobodies ermöglichen und um eine quantitative Erfassung möglich. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und kann mit geringen Kosten, die durch die Möglichkeit der wirksamen Regeneration der magnetischen Beads unterstützt wird festgelegt.

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A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Es ist eine zuverlässige Technik auf der Wechselwirkung zwischen magnetischen Kügelchen und markierten Proteine ​​(zB Nanokörper) einerseits und der Affinität zwischen dem markierten Protein und einem zweiten, markierten Proteins (zB Poliovirus) auf der anderen Seite.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Forschung

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

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Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

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Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

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Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

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Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

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Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...