Name: a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00
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著者らは、放射性標識されたウイルスを調製するための医薬バイオテクノロジーと分子生物学の部門、特にモニーク·デ·Pelsmackerのスタッフに感謝します。私たちは、エレン·メルクスとその興味深い発言や議論のためにHadewych Halewyckに、ラボで彼の助けのためのヘリット·デ·Bleeserに感謝しています。この作品は、財政的にブリュッセル自由大学（OZR1807）、フォンvoor Wetenschappelijk Onderzoe​​kブラーンデレン（G.0168.10N）と世界保健機関（TSA 200410791）のOZRの助成金によって支えられている。リセSchotteはフォンvoor Wetenschappelijk Onderzoe​​kブラーンデレン（FWO）の博士号を取得する前の仲間です。

原則（）とメソッドの概要（B）は図1に示されている。 1。バッファーの調製<ol><li>水の中でリン酸二水素ナトリウム（50 mm）と塩化ナトリウム（300 mM）を溶解することによって結合/洗浄バッファーを準備し、pHを8.0に調整します。さらに、メチオニンツイーン20（0.01％（M / V）の最終濃度）、（2％（M / V）の最終濃度）とアルブミン（0.1％（M / V）の最終濃?...

<ol>
	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

プロトコルでは、nanobodyのと相互作用する抗原の放射能を上清からの放射標識されたウイルスの損失として定義されています。したがって、沈殿した放射能（= 1​​00 - ％）の量は、（磁気ビーズに結合した）上清中の放射能（=％）で間接的な方法で推定することができます。その一方で、それは500 mMのイミダゾールを用いた磁気ビーズから免疫複合体を溶出することにより直接的な方法で?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ダイナHisタグの単離とプルダウン</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt;磁気ビーズ</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;HiSafe 2&#39;</td&gt;<td&gt;パーキンエルマー</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt;シンチレーション流体</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。一つのタンパク質をタグ付けすることができます提供され、別のタンパク質が標識され、このメソッドは、タンパク質 - タンパク質相互作用の調査のために実装することができます。これは、コバルト被覆磁性ビーズによるタグ付きタンパク質の認識に、タグ付きタンパク質と標識された第2の特異的なタンパク質間の相互作用で一方一方に基づいています。最初に、ラベルとタグ融合タンパク質を混合し、室温でインキュベートされています。タグを認識した磁性ビーズは、追加され、標識タンパク質の結合画分は、磁石を使用して非結合画分から分離されています。キャプチャされた標識タンパク質の量は、非結合画分に残った標識タンパク質の信号を測定することにより、間接的な方法で決定することができます。コンフォメーションの変換に敏感なタンパク質が尻である場合に記載の液相親和性アッセイは、非常に便利です。ayed。アッセイの開発とアプリケーションがポリオウイルスとナノボディ1を認識してポリオウイルスの間の相互作用を実証しています。ポリオウイルスは、固体表面（未発表データ）に接続されたコンフォメーションの変換2〜敏感であるため、ELISAの使用が制限されており、液相ベースのシステムは、したがって、優先されるべきである。しばしばpolioresearch 3,4で使用されている液相ベースのシステムの例としては、マイクロタンパク質免疫沈降テスト5です。このテストは、その適用性を実証しているにもかかわらず、それが6,7ナノボディで不在であるFcの構造を必要とします。ただし、別の機会として、これらの興味深いかつ安定した単一ドメイン抗体8は簡単に別のタグを使用して設計することができます。広く（彼の）6-tagはそのような自分の順番で簡単に磁気ビーズ上にコーティングすることができ、ニッケルやコバルトなどの二価イオンに対する親和性を示しています使用されます。したがって、我々はこの単純な定量を開発しましたコバルト被覆磁性ビーズに基づく親和性捕捉アッセイ。ポリオウイルスは、ナノボディで妨害さの相互作用を有効にして定量的な検出が可能にする35 Sで標識した。メソッドは、実行が容易で、さらに効果的に再生磁気ビーズの可能性によってサポートされている、低コストで確立できます。

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A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。それは一方では、磁気ビーズとタグ融合タンパク質（例えば、ナノボディ）との間の相互作用や他のタグ付きタンパク質と第二、標識タンパク質（例えば、ポリオウイルス）との間の親和性に基づく信頼性の高い手法である。

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

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ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

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磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

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中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

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IRE / IRP例：RNA  - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

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生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

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マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...