Name: a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example at JoVE.com

Författarna tackar personalen för avdelningen för farmaceutisk bioteknik och molekylärbiologi och speciellt Monique De Pelsmacker för beredning av den märkta radioaktiva viruset. Vi är tacksamma för Ellen Merckx och Hadewych Halewyck för deras intressanta kommentarer och diskussioner och Gerrit De Bleeser för hans hjälp i labbet. Detta arbete stöds ekonomiskt av en OZR beviljandet av Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) och Världshälsoorganisationen (TSA 200.410.791). Lise Schotte är en predoctoral Fellow vid Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).

Principen (A) och en översikt av förfarandet (B) är avbildade i Figur 1. 1. Beredning av buffert <ol><li> Framställ Bindning / tvätt-buffert genom upplösning av natrium-divätefosfat (50 mM) och natriumklorid (300 mM) i vatten och justera pH till 8,0. Dessutom lägger Tween 20 (0,01% (m / v) slutlig koncentration), metionin (2% (m / v) slutlig koncentration) och albumin (0,1% (m / v) slutlig koncentration) och justera till önskad volym. </li></ol><p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

I protokollet, är radioaktiviteten av antigenet interagera med nanobody definieras som förlust av radiomärkt virus från supernatanten. Därför mängden utfälld radioaktivitet (= 100 - en%) (bundet till de magnetiska pärlorna) kan beräknas på ett indirekt sätt av radioaktiviteten i supernatanten (= en%). Å andra sidan är det också möjligt att mäta radioaktiviteten av den utfällda bundna fraktionen av antigen i ett direkt sätt genom eluering av immunkomplexen från de magnetiska pärlorna med 500 mM imida...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Namn av reagens</strong</td&gt;<td<strong&gt; Företag</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalognummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentarer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-Tag Isolering och Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Magnetiska pärlor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;Hisafe &quot;2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; Scintillationsvätska</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

I denna artikel är en enkel, kvantitativ, vätskefas affinitetsinfångning analys presenteras. Förutsatt att ett protein kan märkas och ett annat protein märkt, kan denna metod implementeras för undersökning av protein-proteininteraktioner. Det är baserat på ena sidan om ett erkännande av det märkta proteinet genom kobolt-belagda magnetiska pärlor och å andra sidan på interaktionen mellan det märkta proteinet och en andra specifikt protein som är märkt. Första, de märkta och märkta proteiner blandades och inkuberades vid rumstemperatur. De magnetiska pärlor, som känner igen den tagg, tillsätts och den bundna fraktionen av märkt protein separeras från den obundna fraktionen med användning av magneter. Mängden av märkt protein som är fångade kan bestämmas på ett indirekt sätt genom att mäta signalen från det märkta proteinet förblev i den obundna fraktionen. Den beskrivna vätskefas affinitet analys är mycket användbart när strukturella omvandling känsliga proteiner assayed. Utvecklingen och tillämpningen av analysen visas för interaktionen mellan poliovirus och poliovirus erkänna nanobodies 1. Eftersom poliovirus är känslig för konformationsförändring omvandlingen 2 när den är bunden till en fast yta (opublicerade resultat), är användning av ELISA begränsad och en flytande fas system bör därför vara att föredra. Ett exempel på en flytande fas system används ofta i polioresearch 3,4 är den mikro protein A-immunoutfällning testet 5. Även om detta test har visat dess tillämpbarhet, kräver det en Fc-struktur, vilket är frånvarande i de nanobodies 6,7. Men som en annan möjlighet, kan dessa intressanta och stabil gemensam-domän-antikroppar 8 enkelt konstruerad med olika taggar. Den allmänt använda (His) 6-taggen visar affinitet för tvåvärda joner, såsom nickel eller kobolt, som kan på sin tur lätt beläggs på magnetiska pärlor. Vi utvecklade därför denna enkla kvantitativaaffinitetsinfångning analys baserad på kobolt-belagda magnetiska pärlor. Poliovirus märktes med 35 S för att obehindrat samverkan med nanobodies och göra en kvantitativ detektering möjligt. Metoden är enkel att utföra och kan fastställas med en låg kostnad, som stöds ytterligare av det möjligt att effektivt regenerera de magnetiska pärlorna.

Watch this Scientific Journal Video about A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example at JoVE.com

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

I denna artikel är en enkel, kvantitativ, vätskefas affinitetsinfångning analys presenteras. Det är en tillförlitlig teknik baserad på interaktionen mellan magnetiska pärlor och märkta proteiner (t.ex. nanobodies) å ena sidan och affiniteten mellan den märkta proteinet och en andra, märkt protein (t. ex poliovirus) på den andra.

En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescens komplement (BiFC) analys av protein-protein interaktion i lök celler med Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en ELISA för att en Luminex xMAP analys med hjälp av en Multiplex metod Antibody Screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifiera protein-proteininteraktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Vuxen Heads av Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Elektrofore Mobility Shift Assay (EMSA) för studier av RNA-proteininteraktioner: The IRE / IRP Exempel

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomvid Protein-proteininteraktion Screening av Protein-fragment kompletteringsanalys (PCA) i levande celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In vivo-studie av Human Endothelial-Pericyte interaktion med hjälp av Matrix Gel Plug-analys i mus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...