Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد ماكس بلانك للطب النفسي والاتحاد الأوروبي وماري كوري شبكة التكوين الأولي (نينا عقد 238665).

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويتزايد الاعتراف برمجة جينية باعتباره آلية هامة الكامنة وراء الصحة والمرض. هنا نقدم اتباع أسلوب دقيق للعزلة في وقت واحد من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من micropunches والخطوات اللاحقة للحصول على ملامح الحامض النووي من خلال التسلسل بيسلفيت. سير العمل الأمثل يسمح تحليل ملائم للبرمجة جينية في الدماغ استجابة للمؤثرات البيئية. وعلاوة على ذلك، ويسهل هذا النهج من التحقيق في العلاقة الوظيفية بين الحامض النووي والجينات كما يتم تحليل كل من نفس العينة. أخيرا، يمكن أن أعداد الحيوانات اللازمة للتجربة انخفاضا كبيرا. وينبغي الأخذ ببعض الاحتياطات والمبادئ التوجيهية أثناء تنفيذ العمل المقدمة. نظرا لتعقيد غير عادية وعدم التجانس في الدماغ ومنذ مثيلة والتعبير نمط قد تختلف بطريقة الخلايا والأنسجة معين هو من أقصىيتم تنفيذ أهمية أن micropunching بطريقة موحدة. كما مثال على ذلك، تم الكشف عن برمجة جينية من AVP في paravaventriuclar، ولكن ليس في النواة فوق البصرية (الشكل 4B-D)، واثنين من AVP معربا عن مناطق ما تحت المهاد 4. في هذا الصدد، وتوافر DNA و RNA من لكمة النسيج نفسه هو مفيد والتعبير RNA من الجينات الأنسجة علامة معينة يمكن استخدامها في بعض الحالات للتصديق على أن تعرض للكم المكان الصحيح. على الرغم من أن micropunching يمكن أن تقلل من عدم التجانس الخلوية، وأنه لا بد من التذكير بأن هذا النهج لا يؤدي إلى عزل أنواع خلية واحدة أو السكان. يمكن أن تعتبر خطوات تنقية إضافية لمعالجة هذا الموضوع. لبيسلفيت التسلسل الأمثل التصميم التمهيدي لتلقي العلاج PCR التضخيم بيسلفيت التالية أمر ضروري. المنتجات يمكن ان PCR يتجاوز 400 شركة بريتيش بتروليوم في طول أن يكون مشكلة بسبب تدهور الحمض النووي من قبل بisulfite العلاج. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن PCR المتداخلة يمكن أن تعطي نتائج منحازة إلا إذا كان بعض القوالب سليمة تسهم في عملية التضخيم. وينبغي تصميم أزواج التمهيدي التي هي محددة لamplicon المحورة؛ متواليات لا ينبغي أن تحتوي على dinucleotides الدليل السياسي الشامل من أجل تجنب مثيلة المنحازة التضخيم. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تحتوي على الاشعال عدم الدليل السياسي الشامل cytosines لمنع تضخيم الحمض النووي معدلة أو تحويلها بشكل غير كامل. قد التضخيم من بعض القوالب الاستفادة من إجراء الساخن بداية PCR. على أي حال، ينبغي التحقق من ملاءمة من أزواج التمهيدي في التجارب الرائدة وذلك لمنع تلف العينات التجريبية قيمة. تسلسل بيسلفيت يمثل طريقة قياسية لتحليل مثيلة في مواقع محددة كما أنها قادرة على موثوق بها وعلى وجه التحديد الكشف عن مثيلة من مخلفات الدليل السياسي الشامل واحدة بطريقة أليل محددة 8. لا ينصح التسلسل المباشر للمنتج PCR كما س مثيلة مختلطواتحاد كرة القدم الدليل السياسي الشامل بقايا تبدو وكأنها ذروة C / T مزدوجة في مخطط رحلاني، التي يمكن أن تمنع الكمي لمثيلة في الموقع المعني. لهذا السبب يجري استنساخ خطوة وسيطة والتسلسل استنساخ عدة (~ 20-30) لتحديد مدى مثيلة. Pyrosequencing يمثل طريقة بديلة لتحديد الحامض النووي. فإنه يستخدم أيضا تحويل بيسلفيت وبيسلفيت PCR ولكن بدلا من استنساخ وتسلسل يتعرض amplicon الى رد فعل pyrosequencing مباشرة حيث يتم قراءة حالة مثيلة من بقايا الدليل السياسي الشامل باعتباره تعدد الأشكال C / تي للتركيبات النووية المنفردة التي يمكن قياسها كميا بسهولة. كلا أساليب الكشف عن مستويات مماثلة من مثيلة 9 ولكن نظرا لأنه يمكن حذف استنساخ خطوة pyrosequencing هو مزيد من الوقت بكفاءة. ومع ذلك، يمكن اعتمادا على قالب تكون متسلسلة فقط 40-100 النيوكليوتيدات في آن واحد بحيث عدة جولات من pyrosequencing التمهيدي مع تسلسل مختلفة ضرورية. هذا هو الحد الحرج، نظرا ثاهناك حاجة إلى كميات أعلى طن من الحمض النووي (حوالي 1 ميكروغرام لكل رد فعل)، وهو المنظور تتجاوز المبالغ المتاحة من اللكمات صغيرة أنسجة المخ. وهكذا المسح الأولي لمناطق واسعة من kilobases عدة pyrosequencing يبدو أقل ملاءمة مثل القراءة استنساخ واحدة. ومع ذلك، ينبغي النظر بعد في التعرف على منطقة صغيرة من pyrosequencing الفائدة. بشكل جماعي، والبروتوكول المذكورة أعلاه توفر نهجا دقيقة وفعالة ومبسطة لتحليل سريع وفعال من حيث التكلفة من micropunches الدماغ لإحداث تغييرات جينية. يمكن معالجة عينات متعددة في تشغيل واحد، والأساليب المناسبة عند تشغيل عينات من التجارب المتوسطة الحجم.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> DNeasy الدم والأنسجة كيت </td><td> QIAGEN </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin الحمض النووي الريبي الثاني </td><td> Macherey-ناجل </td><td> 740955.50 </td></tr><tr><td> Epitect كيت بيسلفيت </td><td> QIAGEN </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin مستخلصات </td><td> Macherey-ناجل </td><td> 740609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T ناقلات الاستنساخ كيت </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-ناجل </td><td> 743100.50 </td></tr><tr><td> مونتاج 96 تسلسل تنظيف </td><td> ميليبور </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar طق البوليميراز </td><td> QIAGEN </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> طق البوليميراز </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

التعرض لاتباع نظام غذائي، يمكن أن المخدرات والمحن في وقت مبكر الحياة خلال النوافذ الحساسة من حياة 1،2 تؤدي إلى تغييرات دائمة في التعبير الجيني التي تسهم في العرض من الظواهر الفسيولوجية والسلوكية. البرمجة البيئية مثل من المرجح أن تزيد من التعرض للأمراض، الأيض القلب والأوعية الدموية والعقلية 3،4. ويعتبر الحامض النووي وتعديلات بسيطة العمليات الرئيسية في وساطة للحوار الجينات والبيئة، ويبدو أيضا أن الأساس الذي تقوم عليه البرمجة البيئية 5. في الثدييات، والحامض النووي وعادة ما تضم ​​إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل في موقف-5 من السيتوزين في سياق dinucleotides الدليل السياسي الشامل. مثلأيشن الدليل السياسي الشامل يحدث بطريقة الأنسجة والخلايا محددة للغاية مما يجعلها تمثل تحديا لدراسة منفصلة، ​​ومناطق صغيرة من المخ حيث التجانس الخلوية عالية وكمية محدودة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، بترتبط ارتباطا وثيقا ecause التعبير الجيني ومثيلة أحداث، يمكن المكتسبة ارتفعت قيمة وبمقارنة كل من المعلمات في نفس العينة. هنا، ويرد على بروتوكول خطوة بخطوة (الشكل 1) للتحقيق في برمجة جينية في الدماغ باستخدام نموذج على &quot;فصل الأمهات&quot; المحن الحياة في وقت مبكر لأغراض التوضيح. بروتوكول يصف إعداد micropunches من أدمغة فئران تفاضلي في سن من الذي يمكن أن الحمض النووي والحمض النووي الريبي معزولة في وقت واحد، مما يسمح لتحليل الحامض النووي والجينات في نفس العينة.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

ويرد تبسيط العمل لدراسة الحامض النووي والتغيرات في التعبير الجيني في وقت مبكر على الحياة التوتر. بدءا من فصل الأمهات من الفئران حديثي الولادة والعزلة من أنسجة المخ المنفصلة، ​​التي نمثلها بروتوكول لعزل في وقت واحد DNA و RNA من اللكمات أنسجة المخ لتسلسل بيسلفيت اللاحقة وتحليل RT-PCR.

الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

التجسيمي جراحة الآفات Excitotoxic من مناطق محددة في الدماغ في الجرذ الكبار

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

تحليل التغييرات التعبير الجيني في الفئران الحصين بعد ديب تحفيز الدماغ الأمامي من مهادي نواة

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...