Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Max Planck Institute of Psychiatry og Den Europæiske Unions Marie Curie Initial Training Network (NINA Kontrakt 238.665).

1. Programmering af Tidlig Life modgang Maternal separation (MS) er udført for at inducere tidlige liv stress (ELS) hos hvalpe leveret af tidsbestemt-gravide C57BL/6N mus (postnatal dag 0 (P0) på dagen for fødslen). <ol><li> Individuelle kuld er placeret i rene bure (med varmepude) i 3 timer dagligt fra P1-10. </li><li> Kontrol (non-ELS) hvalpe forbliver uforstyrret i moderens reden hele vejen igennem. </li><li> Hvalpe holdes med deres mødre, indtil fravænning (P21), hvorefter de er opstaldet i sex-matchede grupper (3-5 mus pr bur) i henhold til standardkontrakter laboratoriedyr boligforhold. </li></ol> 2. Isolering og dissektion af hjernevæv <ol><li> Mus dræbes ved ønskede alder ved cervikal dislokation. Bemærk: for denne protokol indebærer en stress paradigme, der ikke anæstesi indgives før cervikal dislokation, at undgå interferens med normal fysiologisk regulering af stresshormoner. Skulls åbnes ogHjernerne fjernes omhyggeligt og umiddelbart lynfrosset ved nedsænkning i iso-pentan-tøris, før det lagres ved -80 ° C. </li><li> Hjerner cryosectioned (10 um tykkelse); sektioner er monteret på SuperFrost objektglas og holdt ved -20 ° C. Reference til en standard mus stereotaktisk atlas (f.eks Paxinos 6) anvendes til at verificere anatomiske præcision og sikre optagelse af regionen af interesse (f.eks neuroner i den paraventrikulære kernen - PVN - samle sektioner startende ved niveauet for den rostrale PVN, bregma -0,75 til -0,85). </li><li> Sektionerne farves med cresylviolet at lette identifikationen af ​​de forskellige hjernestrukturer. Patricer (0,8 mm) i de områder af interesse (f.eks PVN) opnås ved in loco mikrodissektion. </li></ol> 3. Nucleic Acid Udsugning fra Brain Punches En optimeret protokol til samtidig ekstraktion af DNA og RNA fra bittesmå neuroanatomically-defineret hjerne regioner af bisulfit og genekspression analyser er beskrevet syv. Bemærk: I betragtning af, at RNA er mindre stabil end DNA i GTC-buffer, vi anbefaler behandling RNA først. Homogenatet anvendes til DNA-oprensning kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i løbet af denne tid. <ol><li> Homogenisere slag med en pipette og hvirvelomrøreren i 400 pi guanidiniumthiocyanat (GTC) puffer (4,5 M guanidiniumthiocyanat, 2% N-lauroylsarcosin, 50 mM EDTA, pH 8,25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,1 M p-mercaptoethanol, 0,2% antiskummiddel A) ved stuetemperatur. passerer adskillige gange gennem en hypodermisk sprøjte (29 g) (figur 2) </li><li> Opdelt lysat i lige store dele, både RNA og DNA kan ekstraheres samtidigt eller separat, afhængig af særlige eksperimentelle behov. </li><li> For RNA-oprensning tilsættes 1/10 volumen af ​​NaOAc, 1 volumen AquaPhenol (Appligene) (pH 4) og 1/2 volumen chloroform: isoamylalkohol (24:1) til lysatet. Vortex kraftigt efter hvert trin, oginkuberes på is i 10 minutter, centrifugeres (20 minutter ved 10.000 g ved 4 ° C); tilsættes et lige volumen af ​​70% EtOH til aequous fase. </li><li> Overfør blandingen til en RNA-spinkolonne (f.eks Nucleospin RNA II fra Macherey-Nagel) og udføre på søjlen DNase-fordøjelse og vasketrin (følge fabrikantens protokol); eluerer RNA i 25 ul H2O </li><li> For DNA oprensning en optimeret protokol af Qiagen DNeasy blod og væv Kit bruges. Ækvilibrere lysatet med lige volumener af Buffer AL og 100% EtOH belastning på en Spin Column centrifuge (1 minut ved 10.000 g ved stuetemperatur) og kasseres gennemstrømning. </li><li> Tilsæt 500 pi buffer AW1 herunder 5 ul RNAse (1 mg / ml) til søjlen og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifugering (1 minut ved 10.000 g, stuetemperatur) og kasseres gennemstrømning. </li><li> Vask kolonne med 500 pi puffer AW2 kasseres gennemstrømnings-og spin-tør tom søjle (1 minut ved 15.000 g). </li><li> Tilsættes forvarmet (70 ° C) puffer AE og inkuber kolonner i 10 minutter ved 70 ° C. Eluere ved centrifugering (1 minut, 10.000 g), ansøge igen gennemstrømning og gentage centrifugering. </li></ol> Anvendes et spektrofotometer til at bestemme DNA-og RNA-koncentrationer. En typisk PVN patrice udbytter ~ 600 ng DNA og ~ 400 ng RNA. For genekspressionsanalyse ved kvantitativ PCR (qPCR), typisk anvender vi ~ 100 ng af RNA i revers transkription-reaktionen. 4. Hydrogensulfit Konvertering Natriumbisulfit anvendes til at omdanne ikke-methylerede cytosiner i uraciler. I modsætning hertil er denatureret cytosinerne beskyttet mod konvertering. Derfor er alle cytosinerne, der registreres i den endelige sekventering af hydrogensulfit PCR-amplikon repræsenterer metylerede cytosinerne. Bisulfit omdannelse forårsager væsentlig DNA nedbrydning, der kan være en begrænsende faktor ved PCR-analyse. Optimerede reaktionsbetingelser, som maksimerer cytosin omdannelse reducere DNA-fragmentering og opretholde enkeltstrenget DNA selv ved lavere temperaturer kan opnås ved anvendelseQiagen s EpiTect bisulfit Kit. I vores hænder ~ 200 ng DNA oprenset fra micropunches tilvejebringe en tilstrækkelig mængde af udgangsmaterialet til bisulfit reaktionen. At undgå forskelle i effektiviteten af ​​omdannelsesreaktionen, bør mængden af ​​skabelon DNA holdes konstant blandt alle prøver behandlet ved et eksperiment. Hertil kommer, læser sekvens bør gennemgås for omdannelseseffektivitet ved at undersøge antallet af ikke-konverterede ikke-CpG&#39;er. Denne sats bør overstige 98%. Lavere værdier indikerer ufuldstændige eller ineffektive hydrogensulfit konvertering og de underliggende sekvenser bør udelukkes fra analysen. 5. Hydrogensulfit PCR <ol><li> Konstruktion bisulfit sekvensprimere, der er specifikke for bisulfit omdannet DNA (se diskussionen) Methyl Primer Express software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Da / US / adirect / AB? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602.121), vil støtte dette og hjælpe med til at bestemme optimale annealingstemperaturer i pilotforsøg. </li><li> Fremstille PCR-Master-Mix (for en reaktion) som følger: 2,5 pi 10 x PCR-buffer 0,5 pi 10 mM dNTP&#39;er 1 pi 10 uM fremadrettet primer 1 pi 10pM revers primer 0,125 gl Qiagen Hotstart Taq Plus fylde op til 23 pi med H 2 O </li><li> Tilsættes 2 ul bisulfit behandlede DNA til reaktionen. </li><li> Amplificere anvendelse af følgende betingelser: 1 cyklus 6 min 95 ° C 45-50 cykler af 1 minut 95 ° C, 1 min ved optimale annealingstemperatur, 1 min 72 ° C 1 cyklus 5 min 72 ° C </li></ol> Analysere 7 ul PCR-produkt ved agarosegelelektroforese for at kontrollere størrelsen af ​​amplikon og oprense resterende PCR-reaktion til efterfølgende ligering under anvendelse af en kommercielt tilgængelig PCR-oprensning kit (f.eks Macherey-Nagel Nucleospin Uddrag). I tilfælde yderligere uønskede PCR-produkter opnået, geloprensning anbefales. 6. Hydrogensulfit Sequencing Høj opløsning DNA methylering profiler udledes fra en enkelt klon aflæsninger kan detektere små ændringer i DNA methylering og identificere regulatoriske regioner, der er lydhøre over for behandling (miljø programmering). Den bisulfit sekventering Fremgangsmåden omfatter tre på hinanden følgende arbejdstrin. For det første er PCR-produkter opnået ved kendte bisulfit PCR ligeres ind i en vektor og transformeres ind i bakterier. For det andet er koloni-PCR fra enkelte kloner anvendes til at bestemme den rigtige størrelse af indsatsen. For det tredje er positive koloni PCR ryddet op og udsat for Big-Dye sekventering reaktion. Efter en oprensnings trin, er produkter elektroforesebehandlet på en kapillær sekvenator. 6,1 ligering og transformation Bemærk: Vi rutinemæssigt bruger pGEM-T-vektor cloning kit (Promega). I vores erfaring, afhænger kloningseffektiviteten kritisk på indsatsen, der skal ligeres. Forskellige vektorer bør testes i tilfælde lavt antal rekombinante kloner gentagne opnås. <ol><li> Nedsat ligeringsreaktion: 5 ul 2x ligeringspuffer 1 pi pGEM-T-vektor 1 pi T4-ligase 3 pi rensede PCR-produkt </li><li> Blandes reaktionsblandingen ved pipettering og inkuberes natten over ved 4 ° C. Bemærk: Ligering kan også udføres i 1 time ved stuetemperatur også. At øge antallet af rekombinante kloner, natten over ligering ved 4 ° C foretrækkes. </li><li> Oprensning af ligeringsprodukter ved ethanolfældning: <ol class="lalpha"><li> Tilsæt 1 pi glycogen, 1 pi 3 M NaAc og 25 pi 100% EtOH til ligeringsreaktionen og præcipitatet i 1 min i flydende nitrogen. </li><li> Centrifuge (15,0000 g i 30 minutter ved 4 ° C) og kasseres supernatanten. </li><li> Vask med 300 gl70% EtOH og centrifugeres (15.000 g i 20 minutter ved 4 ° C), kasseres supernatanten og tør pellet ved stuetemperatur (10 min). </li><li> Resuspender pellet i 10 pi H2O </li></ol></li></ol> 6,2 Transformation af ligeringsprodukter i elektrokompetente bakterier <ol><li> Precool elektroporation kuvetter (1 mm bredde) på is og tø aliquot af elektrokompetente DH5a bakterier på is. </li><li> Tilsæt 45 gl DH5a bakterier til 10 pi ryddet op ligeringsprodukt (se ovenfor) og overføres til kuvetten. </li><li> Transformere bakterier på 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF og tilsæt 1 ml forvarmet SOB-medium umiddelbart efter puls levering. </li><li> Genvinde bakterier i 1 time ved 37 ° C, spredes 100 ul af suspensionen på LB / ampicillin plader overtrukket med IPTG / X-Gal. </li><li> Pladerne inkuberes natten over ved 37 ° C. </li></ol> 6,3 koloni-PCR Bemærk: Koloni PCR fra enkelte kloner udføres for at sikre, at skærene eraf den forventede størrelse. Forsinket farveudvikling fra den blå / hvide screening, uønskede rekombinationsbegivenheder begivenheder i ligatur, inkorporering af oligomere primerpar eller trunkerede PCR-produkter som ellers kan føre til defekte sekventering resultater. Vi anvender rutinemæssigt T7 og SP6 primere til at amplificere klonede inserts; Denne fremgangsmåde resulterer i yderligere vektorsekvenser på omkring 150 bp. T7-primer anvendes i sekventering reaktionen i et senere trin. <ol><li> Nedsat koloni PCR-reaktion i 96-brønds plade. For en reaktion anvendes: 3 ul 2,5 mM MgCl2 2,5 pi 10 x Taq-puffer 1,5 gl 10 mM dNTP 2 ul 2,5 mM T7-primer 2 ul 2,5 mM SP6 primer 1 pi Fermentas Taq Polymerase fylde op til 25 pi med H2O </li><li> Dispensere 25 gl / brønd af stamblandingen i hver brønd af en 96-brønds plade. </li><li> Vælg en positiv (hvid) klon fra tallerken med pipettespids og dip til PCR-reaktion. </li><li> Forstærk hjælp følgende betingelser: 1 cyklus 4 minutter ved 95 ° C 10 cyklusser 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 56 ° C og 30 s ved 72 ° C 30 cykler 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 48 ° C og 30 s ved 72 ° C 1 cyklus 5 min ved 72 ° C </li><li> Indlæse 5 ul af koloni-PCR på en agarosegel og bestemme reaktioner, der indeholder den rigtige insert størrelse. </li><li> Kolonidannende PCR&#39;er indeholdende de ønskede amplikoner renset ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (Machery Nagel Nucleofast). </li></ol> 6,4 Big-Dye Terminator reaktion og sekventering <ol><li> Forbered Master mix for Big-Dye reaktion. For en reaktion anvendes: 1 pi H2O 0,5 gl Big-Dye reagens 1,5 pi Sekventering puffer </li><li> Dispensere 3 gl / brønd i hver brønd af en 96-brønds plade, til hver brønd tilsættes 2 ul renset koloni-PCR-produktet og køre reaktionen i en thermocycler med følgende parametre: 35 cykler af 10 sek ved 96 ° C, 5 sekunder ved 50 ° C og 4 minutter ved 60 ° C </li><li> The Big-Dye reaktion renses op ved hjælp af et kommercielt kit (Millipore Montage 96 Sekventering Clean-Up Kit) og behandles på en kapillær sequencer (f.eks ABI 3100 DNA). </li><li> Sekvenser analyseres ved hjælp af BiQ Analyzer ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) eller online-værktøjet Bisma ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) at udlede den methylering mønster af undersøgte DNA-region (figur 4). </li></ol> 7. Repræsentative resultater For at få indblik i indflydelse ELS på AVP udtryk og methylering status, blev C57BL/6N mus behandlet i henhold til arbejdsgangen er beskrevet ovenfor. Kort fortalt, en gruppe C57BL/6N mus blev subjected til ELS, mens kontrolgruppen blev efterladt uforstyrret. Den PVN og supraoptic kerne (SON) blev udstanset og DNA og RNA blev isoleret samtidigt fra de enkelte stempler. RNA blev revers transkriberet og niveauerne af AVP-transkripter blev målt ved qPCR analyse og normaliseret til ekspressionen af HPRT-og GAPDH husholdning gener. DNA blev bisulfit behandlede amplificeret med primere specifikke for AVP enhancer (fig. 4a) og PCR-produkterne blev klonet og sekventeret. Mindst 20 rekombinante kloner fra hver mus / PCR blev analyseret for at bestemme methylering frekvenser for de CpG&#39;er indeholdt i PCR-amplikon (figur 4b). Sammenlignet med kontrol, inducerede ELS en betydelig hypometylering på CpG10, CpG12, CpG13 og Cpg14 af AVP enhancer (p &lt;0,05, n = 6-8 dyr), hvilket tyder epigenetiske mærkning af denne reguleringsmulighed regionen gennem den tidlige livserfaringer. I modsætning til PVN, methylering afAVP enhanceren var upåvirket af ELS i SON illustrerer vævsspecificitet af epigenetisk mærkning (fig. 4c). Analyse af DNA methylering status på CpG10 og AVP genekspression i kontroldyr (n = 6) viste en negativ korrelation peger på en rolle af DNA methylering i finjustering af AVP genekspression (fig. 4d). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Figur 1. Micropunches stammer fra dissekerede hjerner fra kontrol og tidlige liv stressede mus. Efter DNA-og RNA-isolering, er gen-ekspression bestemmes ved QRT-PCR under bisulfit behandlede DNA amplificeres og oprensede produkter klones i en egnet vektor til identifikation af rekombinante kloner ved blå / hvid selektion. Insert størrelser verificeret afkoloni-PCR forud for udførelsen af ​​Big-Dye reaktion og forarbejdning på et kapillært sekvenator. Methylering mønster visualiseres ved passende softwareværktøjer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figur 2. Tidslinje fra DNA / RNA-ekstraktion til bisulfit sekventering. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figur 3. Arbejdsgang til samtidig udvinding af DNA og RNA. Dornen af hypothalamus kernen paraventricularis, en lille AVP-gen udtrykker hjerneregion, anbringes i 400 pi GTA puffer, hvirvelbehandles indtil afbrudt, og yderligere homogeniseret ved passage gennem en sprøjte (29 g). Homogenatet derefter delt til oprensning af RNA og DNA. Opdelingen kan være 1:1 eller forskellige forhold afhængigtden særlige eksperimentelle spørgsmål. Homogenater skal behandles inden for få timer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figur 4. CpG methylation i AVP locus i 6 uger gamle kontrol og ELS dyr. (A) Ordning af AVP og oxytocin-generne orienteret hale til-hale og adskilt af den intergeniske region (IGR). Exonerne er vist ved åbne (nummereret) kasser. Fordelingen af ​​CpG rester er angivet, og størrelsen og placeringen af ​​den respektive PCR-amplikon indeholdende CpG 10 til CpG14 er markeret med en fed linje. (B) Methylering af AVP enhanceren i PVN i kontrol-og ELS dyr (n = 6-8). (C) Methylering af AVP forstærker i SON i kontrol og ELS dyr (n = 8-10). (D) AVP genekspression blev korreleretmed methylering på CpG10 (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Epigenetiske programmering er i stigende grad anerkendt som en vigtig mekanisme bag sundhed og sygdom. Her præsenterer vi en raffineret metode til samtidig isolering af DNA og RNA fra micropunches og de efterfølgende skridt til at indhente DNA methylering profiler gennem hydrogensulfit sekventering. Den optimerede workflow tillader bekvem analyse af epigenetiske programmering i hjernen som reaktion på miljømæssige stimuli. Endvidere er denne fremgangsmåde letter undersøgelsen af ​​det funktionelle forhold mellem DNA-methylering og genekspression, som begge er analyseret fra den samme prøve. Endelig kan antal dyr, der er nødvendige til forsøget reduceres betydeligt. Visse forholdsregler og retningslinjer skal følges, mens de udfører den præsenterede arbejdsgang. Betragtning af den usædvanlige kompleksitet og heterogeniteten af ​​hjernen, og da methylering og ekspressionsmønster kan variere i en celle-og vævsspecifik måde er det af størstebetydning, micropunching udføres på en standardiseret måde. Som et eksempel herpå er epigenetisk programmering af AVP detekteret i paravaventriuclar, men ikke i supraoptic kernen (fig. 4b-d), to AVP udtrykker regioner hypothalamus 4. I denne henseende er tilgængeligheden af ​​DNA og RNA fra det samme væv dornen fordelagtig RNA ekspression af visse vævsspecifikke markørgener kan anvendes i nogle tilfælde at bekræfte, at det korrekte område blev udstanset. Selv micropunching kan reducere cellulær heterogenitet, må det erindres, at denne fremgangsmåde ikke fører til isolation af enkelte celletyper eller befolkninger. Yderligere oprensningstrin kan anses for at løse dette emne. For bisulfit sekventering optimal primer designet til PCR amplifikation følgende behandling med bisulfit er afgørende. PCR produkter, der overskrider 400 bp i længde kan være problematisk på grund af nedbrydning af DNA ved bisulfite behandling. Det skal også bemærkes, at nested PCR kan give skæve resultater hvis kun nogle få intakte skabeloner bidrager til amplifikationsprocessen. Primerpar der er specifikt for den modificerede ampliconen bør designes; deres sekvenser ikke bør indeholde CpG-dinukleotider, for at undgå methylering-forspændte amplifikation. Endvidere bør primerne indeholder ikke-CpG cytosiner at forhindre amplifikation af umodificeret eller ufuldstændigt omdannet DNA. Forstærkning af nogle skabeloner kan drage fordel af at gennemføre Hot-start PCR. Under alle omstændigheder bør egnethed primerpar kontrolleres i pilotforsøg for at forhindre ødelæggelse af værdifulde eksperimentelle prøver. Bisulfit sekventering repræsenterer en standard fremgangsmåde til site-specifik methyleringsanalyse, som det er i stand til pålideligt og præcist detektere methylering af enkelt CpG rester i en allel-specifik måde 8. Direkte sekventering af PCR-produktet anbefales ikke som blandet methylering oFA CpG rest vil fremstå som en C / T dobbelt top i elektroferogrammet, som kan forhindre kvantificering af methylering på den pågældende lokalitet. Af denne grund en mellemliggende kloningstrin udføres, og adskillige kloner sekventeret (~ 20-30) for at bestemme omfanget af methylering. Pyrosekventering repræsenterer en alternativ metode til kvantificering DNA metylering. Desuden anvender bisulfit omdannelse og bisulfit PCR, men i stedet for kloning og sekventering af amplikon underkastes en direkte pyrosekventering reaktion, hvor status for methylering af et CpG rest læses som en C / T enkelt nukleotidpolymorfisme, der let kan kvantificeres. Begge metoder opdage lignende niveauer af methylering 9, men da kloningen-trin kan udelades pyrosekventering er mere tidsbesparende. Imidlertid afhængig af skabelonen kun 40-100 nukleotider kan sekventeres på en gang, således at flere runder af pyrosekventering med forskellige sekventeringsprimer er nødvendige. Dette er et kritisk begrænsning, da THAt større mængder af DNA (ca. 1 mg pr reaktion) er påkrævet, hvilket overskuelig overstige de beløb til rådighed fra bittesmå hjernevæv slag. Således indledende scanning af regioner i rækken af ​​flere kilobaser af pyrosekventering synes mindre egnet som en enkelt klon læsning. Ikke desto mindre bør efter på identifikation af et lille område af interesse pyrosekventering overvejes. Samlet protokollen beskrevet ovenfor giver en præcis, effektiv og strømlinet tilgang til hurtig og omkostningseffektiv analyse af hjernen micropunches for epigenetiske ændringer. Flere prøver kan behandles på en enkelt kørsel og fremgangsmåder er egnede, når de kører prøver fra mellemprodukt størrelse eksperimenter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955,50 </td></tr><tr><td> Epitect hydrogensulfit Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T-vektor Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sekvensering Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq Polymerase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

Udsættelse for kost, kan stoffer og tidlige liv modgang i løbet af følsomme vinduer i livet 1,2 fører til varige ændringer i genekspression, der bidrager til visning af fysiologiske og adfærdsmæssige fænotyper. En sådan miljømæssig programmering er sandsynligvis øge modtageligheden for metaboliske, kardiovaskulære og psykiske sygdomme 3,4. DNA methylering og histon-modifikationer betragtes nøgleprocesser i formidlingen af den gen-miljø dialog og synes også at ligget til grund for miljøet programmering 5. I pattedyr, typisk DNA metylering omfatter den kovalente addition af en methylgruppe ved 5-stillingen af ​​cytosin i forbindelse med CpG-dinukleotider. CpG methylation forekommer i en meget vævs-og celle-specifik måde at gøre det udfordring at studere diskrete små områder af hjernen, hvor cellulær heterogenicitet er høj og væv mængde begrænset. Desuden barbejdsmarkedet, idet genekspression og methylering er tæt forbundet begivenheder, kan øget værdi opnås ved at sammenligne begge parametre i den samme prøve. Her er en trin-for-trin-protokollen (figur 1) til undersøgelse af epigenetiske programmering i hjernen præsenteres efter den &#39;moderens separation &quot;paradigme for tidlige liv modgang til illustrative formål. Protokollen beskriver fremstillingen af ​​micropunches fra differentielt ældede musehjerner hvorfra DNA og RNA kan samtidigt isoleres, således at DNA-methylering og genekspressionsanalyse i den samme prøve.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

En strømlinet arbejdsgang til at studere DNA methylering og genekspression ændringer ved tidlige-life stress vises. Gående ud fra moderens adskillelse af nyfødte mus og isolering af diskrete hjernevæv, vi repræsenterer en protokol til samtidig isolering af DNA og RNA fra hjernevæv patricer til efterfølgende bisulfit sekventering og RT-PCR-analyse.

Optimeret Analyse af DNA methylering og genekspression fra små, anatomisk definerede områder af hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaktisk kirurgi for excitotoksiske læsion af specifikke områder i hjernen i den voksne rotte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodissektion af beriget populationer af neuroner eller enkelte neuroner til genekspression analyse efter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipuleringer af genekspression i Adult zebrafisk Brain Brug Cerebroventricular mikroinjektion af Morpholino oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analyse af differentiel genekspression i elektroporerede Chick embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Forberedelse af akut hjernen skiver bruger en optimeret N-Methyl-D-glucamine beskyttende genoprettelsesmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...