Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het Max Planck Instituut voor Psychiatrie en de Europese Unie Marie Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665).

1. Programmering door Early Life tegenspoed Scheiding van de moeder (MS) wordt uitgevoerd om de jeugd stress (ELS) te induceren in pups geleverd door timed-zwangere C57BL/6N muizen (postnatale dag 0 (P0) op de dag van geboorte). <ol><li> Individuele nesten worden in schone kooien (met verwarmingselement) voor 3 uur per dag van P1-10. </li><li> Control (niet-ELS) pups blijven ongestoord in de moederlijke nest in. </li><li> Pups zijn die door hun moeder tot het spenen (P21), waarna ze worden ondergebracht in geslacht gematchte groepen (3-5 muizen per kooi) onder standaard laboratorium huisvesting van dieren. </li></ol> 2. Isolatie en dissectie van hersenweefsel <ol><li> Muizen worden gedood op de gewenste leeftijd door cervicale dislocatie. Opmerking: omdat dit protocol gaat om een stress-paradigma, geen verdoving wordt gegeven voorafgaande aan cervicale dislocatie, om te voorkomen dat de normale fysiologische regulatie van stresshormonen. Schedels worden geopend enhersenen zorgvuldig verwijderd en onmiddellijk snel bevroren door onderdompeling in iso-pentaan-droogijs, alvorens te worden opgeslagen bij -80 ° C. </li><li> Hersenen cryosectioned (10 urn dik) secties gemonteerd Superfrost glasplaatjes en gehandhaafd bij -20 ° C. Verwijzing naar een standaard muis stereotaxische atlas (bijv. Paxinos 6) wordt gebruikt om anatomische precisie te controleren en om opname van de regio van belang (bijvoorbeeld voor neuronen in de paraventriculaire kern te garanderen - PVN - verzamelen secties beginnen op het niveau van de rostrale PVN, bregma -0,75 tot -0,85). </li><li> Secties worden gekleurd met cresyl violet tot de identificatie van de verschillende hersenstructuren te vergemakkelijken. Ponsen (0,8 mm) van de regio&#39;s van belang (bijv. PVN) worden verkregen door in loco microdissectie. </li></ol> 3. Nucleic Acid Extractie van Brain Ponsen Optimaliseren van een protocol voor het gelijktijdig het extraheren van DNA en RNA van de kleine neuroanatomically gedefinieerde hersenen regionen bisulfiet en genexpressie analyses beschreven 7. Opmerking: Gezien het feit dat RNA is minder stabiel dan DNA in de GTC-Buffer, raden wij aan de verwerking van RNA eerst. Het homogenaat gebruikt voor DNA zuivering kan worden bewaard bij kamertemperatuur (RT) in die tijd. <ol><li> Meng stoten met een pipet vortexer in 400 ul guanidiniumthiocyanaat (AV) buffer (4.5 M guanidinium thiocyanate, 2% N-lauroylsarcosine, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-mercaptoethanol, 0,2% schuimwerend A) bij KT, langs een aantal keren door een injectiespuit (29g) (Figuur 2). </li><li> Splits lysaat in gelijke delen, zowel RNA als DNA kan worden gewonnen tegelijkertijd of afzonderlijk, afhankelijk van bijzondere experimentele behoeften. </li><li> Voor RNA-zuivering voeg 1/10 volume van NaOAc, een volume AquaPhenol (Appligene) (pH 4) en 1/2 volume chloroform isoamyl (24:1) aan lysaat. Vortex krachtig na elke stap enincuberen op ijs gedurende 10 minuten gecentrifugeerd (20 min bij 10.000 g bij 4 ° C), een gelijk volume van 70% EtOH aequous fase. </li><li> Breng mengsel aan een RNA-spin-kolom (bijvoorbeeld Nucleospin RNA II van Macherey-Nagel) en het uitvoeren van on-column DNase-vergisting en wasstappen (volg de fabrikant protocol); elueer RNA in 25 ul H 2 O. </li><li> Voor DNA-zuivering optimaliseren van een protocol van de Qiagen DNeasy bloed en weefsel Kit wordt gebruikt. Evenwicht lysaat met gelijke volumina van buffer AL en 100% EtOH, belasting op Spin kolom centrifuge (1 min bij 10.000 g bij kamertemperatuur) en doorstroming verwijderen. </li><li> Voeg 500 ul Buffer AW1 met 5 pi RNAse (1 mg / ml) kolom en incuberen 10 min bij KT. Spin (1 min bij 10.000 g, RT) en gooi de doorstroming. </li><li> Was kolom met 500 ul buffer AW2, gooi doorstroom en spin-droge lege kolom (1 min bij 15.000 g). </li><li> Voeg voorverwarmde (70 ° C) Buffer AE en incubeer kolommen 10 min bij 70 ° C. Elueren door centrifugeren (1 min, 10.000 g), opnieuw toe te passen doorstroom en herhaal centrifugatiestap. </li></ol> Gebruik een spectrofotometer om DNA-en RNA-concentraties te bepalen. Een typisch PVN punch opbrengsten ~ 600 ng DNA en ~ 400 ng RNA. Voor analyse van genexpressie door kwantitatieve PCR (qPCR), we meestal gebruik ~ 100 ng van RNA in de omgekeerde transcriptie reactie. 4. Bisulfiet Conversie Natriumbisulfiet wordt gebruikt om niet-gemethyleerde cytosines converteren naar uracils. In tegenstelling, zijn gemethyleerde cytosines beschermd tegen conversie. Daarom zijn alle cytosines die worden gedetecteerd in de uiteindelijke volgorde van de bisulfiet PCR-amplicon vertegenwoordigen gemethyleerde cytosines. Bisulfiet conversie leidt tot aanzienlijke DNA-degradatie die kan een beperkende factor zijn in de PCR-analyse. Optimale reactieomstandigheden die cytosine conversie maximaliseren verminderen DNA fragmentatie en handhaven enkelstrengs DNA ook bij lagere temperaturen kunnen worden bereikt metEpiTect bisulfiet Qiagen&#39;s Kit. In onze handen ~ 200 ng DNA gezuiverd uit micropunches een voldoende hoeveelheid uitgangsmateriaal voor de reactie bisulfiet. Om verschillen in de efficiëntie van de omzettingsreactie te voorkomen, dient de hoeveelheid template DNA constant gehouden onder alle monsters verwerkt in een experiment. Daarnaast volgorde leest moeten worden onderzocht voor de conversie-efficiëntie door het onderzoeken van het percentage niet-omgezette niet-CpGs. Dit percentage moet hoger zijn dan 98%. Lagere waarden duiden op onvolledige of inefficiënt bisulfiet conversie en de onderliggende sequenties worden uitgesloten van de analyse. 5. Bisulfiet PCR <ol><li> Ontwerp bisulfiet sequencing primers die specifiek zijn voor bisulfiet omgezet DNA (zie bespreking); Methyl Primer Express-software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Nl / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) zal helpen dit en helpen om een optimale gloeien temperaturen in pilot experimenten vast te stellen. </li><li> Bereid PCR-Master-Mix (voor een reactie) als volgt: 2.5 ul PCR-buffer 10x 0,5 ul 10 mM dNTP 1 pi 10 uM voorwaartse primer 1 pi 10 uM reverse primer 0,125 ul Qiagen Hotstart Taq Plus vullen tot 23 ßl met H2O </li><li> Voeg 2 pi bisulfiet behandelde DNA reactie. </li><li> Amplify met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus 6 min 95 ° C 45-50 cycli van 1 min. 95 ° C, 1 min bij optimale hybridisatietemperatuur 1 min 72 ° C 1 cyclus 5 min 72 ° C </li></ol> Analyse 7 pi PCR product met behulp van agarosegelelektroforese de grootte van het amplicon controleren en resterende PCR-reactie voor de daaropvolgende ligatie met een commercieel verkrijgbare PCR sanering kit (zuiveren bijvoorbeeld Macherey-Nagel Nucleospin Extract). Bij additionele ongewenste PCR-producten worden verkregen, wordt zuivering op gel aanbevolen. 6. Bisulfiet Sequencing Hoge resolutie DNA-methylatie profielen afgeleid uit enkele kloon metingen kunnen detecteren kleine veranderingen in DNA methylatie en nagaan welke regelgevende regio&#39;s die inspelen op de behandeling (milieu-programmering). De bisulfiet sequentie werkwijze omvat drie opeenvolgende stappen werken. Ten eerste zijn PCR producten verkregen door voorafgaande bisulfiet PCR geligeerd in een vector en omgezet in bacteriën. Ten tweede wordt kolonie-PCR van enkele klonen toegepast om de juiste grootte van het inzetstuk te bepalen. Ten derde worden positieve kolonie PCR&#39;s opgeruimd en onderworpen aan Big-Dye sequencing reactie. Na een clean-up stap worden de producten geëlektroforeerd op een capillaire sequencer. 6,1 ligatie en transformatie Let op: We routinematig gebruik maken van de pGEM-T vector cloning kit (Promega). Onze ervaring is dat de kloneringsefficiëntie mate afhankelijk zijn van de insert te ligeren. Verschillende vectoren worden getest bij lage aantal recombinante klonen herhaaldelijk verkregen. <ol><li> Stel ligatie reactie: 5 pi 2x ligatiebuffer 1 pi pGEM-T Vector 1 pi T4-Ligase 3 pi opgeschoond PCR product </li><li> Meng reactie van pipetteren en incubeer overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Ligatie kan ook worden uitgevoerd gedurende 1 uur bij RT ook. Om aantal recombinante klonen verhogen overnacht ligatie bij 4 ° C de voorkeur. </li><li> Reiniging van ligatieproducten door ethanolprecipitatie: <ol class="lalpha"><li> Voeg 1 pi glycogeen, 1 ul 3M NaAc en 25 pl 100% EtOH de ligatiereactie neerslag gedurende 1 minuut in vloeibare stikstof. </li><li> Centrifuge (15,0000 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C) en gooi supernatant. </li><li> Was met 300 ul70% EtOH en gecentrifugeerd (15000 g 20 minuten bij 4 ° C), verwijderen supernatant en pellet bij kamertemperatuur droog (10 min). </li><li> Resuspendeer pellet in 10 ul H 2 O. </li></ol></li></ol> 6.2 Transformatie van ligatieproducten in electrocompetente bacteriën <ol><li> Precool elektroporatie cuvetten (1 mm breedte) op ijs en dooi hoeveelheid van elektrocompetente DH5a bacteriën op ijs. </li><li> Voeg 45 ul DH5a bacteriën tot en met 10 ul opgeruimd ligatieproduct (zie hierboven) en over te dragen aan cuvette. </li><li> Maak van bacteriën op 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF en voeg 1 ml voorverwarmde SOB medium direct na de puls levering. </li><li> Herstel bacteriën gedurende 1 uur bij 37 ° C, verdeeld 100 ul suspensie op LB / ampicilline bekleed met IPTG / X-Gal. </li><li> Incubeer plaatjes gedurende een nacht bij 37 ° C. </li></ol> 6,3 kolonie-PCR Let op: Colony PCR van enkele klonen wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de inserts zijnvan de voorspelde grootte. Vertraagde kleur ontwikkeling van de blauw / witte screening, ongewenste recombinatie gebeurtenissen tijdens ligatie, integratie van oligomere primerparen of ingekort PCR-producten kunnen dan immers leiden tot defecte sequencing resultaten. We routinematig gebruik van T7 en SP6 primers om gekloonde inserts versterken; deze aanpak leidt tot extra vector sequenties van ongeveer 150 bp. T7 primer wordt gebruikt in de sequentie reactie in een later stadium. <ol><li> Stel kolonie PCR-reactie in 96-wells plaat. Voor een reactie gebruikt: 3 pi 2,5 mM MgCl2 2,5 pl Taq 10x buffer 1,5 pi 10 mM dNTP 2 pi 2,5 mM T7 primer 2 pi 2,5 mM SP6 primer 1 pi Taq polymerase Fermentas vullen tot 25 ßl met H2O </li><li> Doseer 25 ul / putje van de master mix in elke well van een 96-wells plaat. </li><li> Kies een positieve (wit) kloon van de plaat met pipetpunt en duik in PCR-reactie. </li><li> Amplify met folde volgende voorwaarden: 1 cyclus 4 min bij 95 ° C 10 cycli 30 s bij 94 ° C, 30 seconden bij 56 ° C en 30 s bij 72 ° C 30 cycli 30 s bij 94 ° C, 30 seconden bij 48 ° C en 30 s bij 72 ° C 1 cyclus 5 min bij 72 ° C </li><li> Plaats 5 pi kolonie-PCR op een agarosegel en bepalen reacties die de juiste insertgrootte bevatten. </li><li> Kolonie PCRs die de gewenste amplicons worden gereinigd met behulp van een commercieel verkrijgbare kit (Nagel Machery Nucleofast). </li></ol> 6,4 Big-Dye terminator reactie en sequencing <ol><li> Bereid Master mix voor Big-Dye reactie. Voor een reactie gebruikt: 1 pi H2O 0,5 ul Big-Dye reagens 1,5 ul Sequencing buffer </li><li> Breng 3 ul / putje in elk putje van een 96-wells plaat, aan elk putje toegevoegd 2 pi schoongemaakt kolonie-PCR product en uitvoeren reactie op een thermocycler met de volgende parameters: 35 cycli van 10 seconden bij 96 ° C, 5 sec bij 50 ° C en 4 min bij 60 ° C </li><li> De Big-Dye reactie wordt opgeruimd met behulp van een commerciële kit (Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit) en verwerkt op een capillaire sequencer (bijv. ABI 3100 DNA). </li><li> Sequenties worden geanalyseerd met behulp van de Biq Analyzer ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) of de online tool Bisma ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) het afleiden van de methylering patroon van de onderzochte DNA (Figuur 4). </li></ol> 7. Representatieve resultaten Om inzicht te krijgen in de invloed van ELS op de AVP expressie en methylatie status te verkrijgen, werden C57BL/6N muizen verwerkt volgens de workflow hierboven beschreven. Kortom, een groep C57BL/6N muizen was deubjected naar ELS, terwijl de controlegroep werd ongemoeid gelaten. De PVN en de supraoptische kern (SON) werden geslagen en DNA en RNA werden tegelijkertijd geïsoleerd van de enkele stoten. RNA werd reverse getranscribeerd en de niveaus van Avp transcripten werden gemeten door qPCR analyse en genormaliseerd op de expressie van HPRT en GAPDH housekeeping genen. DNA werd bisulfiet behandeld, geamplificeerd met primers specifiek voor de Avp versterker (figuur 4a) en de PCR producten werden gekloond en gesequentieerd. Ten minste 20 recombinante klonen uit elke muis / PCR werd geanalyseerd om methylering frequenties bepalen de CpGs in de PCR amplicon (figuur 4b). In vergelijking met controles, ELS leidden tot een significante hypomethylatie op CpG10, CpG12, CpG13 en Cpg14 van de AVP enhancer (p &lt;0,05, n = 6-8 dieren) suggereert epigenetische markering van deze regelgeving regio door middel van vroege levenservaringen. In tegenstelling tot de PVN methylering vanDe AVP versterker werd niet beïnvloed door ELS in de Zoon illustreren weefsel specificiteit van epigenetische markering (Figuur 4c). Analyse van het DNA-methylatie status bij CpG10 en AVP expressie van genen in de controle dieren (n = 6) blijkt een negatieve correlatie te wijzen op een rol van DNA-methylatie in de fine-tuning van de AVP genexpressie (figuur 4d). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Figuur 1. Micropunches zijn verkregen uit ontleed hersenen van controle en de jeugd benadrukt muizen. Na DNA en RNA isolatie wordt genexpressie bepaald door qRT-PCR terwijl bisulfiet behandeld DNA wordt versterkt en gezuiverde producten worden gekloneerd in een geschikte vector identificatie van recombinant-klonen door blauw / wit selectie. Correct insert maten zijn gecontroleerd doorkolonie PCR voorafgaand aan het uitvoeren van Big-Dye reactie en verwerking op een capillaire sequencer. Methylatiepatroon worden gevisualiseerd door middel van passende software tools. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figuur 2. Tijdlijn van DNA / RNA extractie naar bisulfiet sequencing. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figuur 3. Workflow voor de gelijktijdige winning van DNA en RNA. De stempel van de hypothalamus kern paraventricularis, een klein Avp gen uiten gebied van de hersenen, wordt geplaatst in 400 ul GTA buffer, vortex tot verstoord en verder gehomogeniseerd door het passeren van een injectiespuit (29g). Het homogenaat wordt opgesplitst voor de zuivering van RNA en DNA. De splitsing kan 1:1 zijn of verschillende verhoudingen afhankelijkde bepaalde experimentele vraag. Homogenaten moeten worden verwerkt binnen een paar uur. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figuur 4. CpG methylering op de AVP locus in 6 weken oud-controle en ELS dieren. (A) Regeling van de AVP en oxytocine genen georiënteerd staart aan staart-en gescheiden door de intergene regio (IGR). Exonen worden weergegeven door open (genummerde) dozen. De verdeling van CpG residuen wordt vermeld en grootte en de positie van de respectieve PCR-amplicon met CpG 10 tot CpG14 wordt gekenmerkt door een dikke lijn. (B) Methylering van de AVP enhancer in de PVN in de controle en ELS dieren (n = 6-8). (C) Methylering van de AVP enhancer in de Zoon in de controle en ELS dieren (n = 8-10). (D) Avp genexpressie werd gecorreleerdmet de methylatie van CpG10 (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Epigenetische programmering wordt steeds meer erkend als een belangrijk mechanisme dat ten grondslag gezondheid en ziekte. Hier vormen een verfijnde methode voor de gelijktijdige isolatie van DNA en RNA uit micropunches en de volgende stappen DNA methylering profielen verkrijgen door bisulfiet sequencing. De geoptimaliseerde workflow maakt gemakkelijke analyse van epigenetische programmering in de hersenen als reactie op prikkels uit de omgeving. Bovendien is deze aanpak maakt het onderzoek naar de functionele relatie tussen DNA methylatie en gen-expressie als beide worden geanalyseerd uit dezelfde steekproef. Tot slot kan het aantal dieren nodig zijn voor het experiment aanzienlijk worden verminderd. Sommige voorzorgsmaatregelen en richtlijnen moeten worden gevolgd tijdens het uitvoeren van de gepresenteerde workflow. Gezien de buitengewone complexiteit en de heterogeniteit van de hersenen en sinds methylatie en expressie patroon kan variëren in een cel-en weefsel specifieke manier is het van grootbelang dat micropunching wordt uitgevoerd op een gestandaardiseerde manier. Als voorbeeld wordt epigenetische programmering van Avp gedetecteerd in de paravaventriuclar, maar niet in de supraoptic nucleus (figuur 4b-d), twee Avp expressie gebieden van de hypothalamus 4. In dit verband beschikbaarheid van DNA en RNA uit hetzelfde weefsel punch voordelig als RNA-expressie van bepaalde weefselspecifieke markergenen worden in sommige gevallen te bevestigen dat het juiste gebied is geperforeerd. Hoewel micropunching kan verminderen cellulaire heterogeniteit, moet worden herinnerd dat deze aanpak niet leidt tot de isolatie van enkele cel soorten of populaties. Extra zuiveringsstappen kunnen worden beschouwd dit onderwerp pakken. Voor bisulfiet sequencing primer optimaal ontwerp voor PCR-amplificatie volgende bisulfiet behandeling is essentieel. PCR producten dan 400 bp in lengte problematisch door de afbraak van DNA door bisulfite behandeling. Ook moet worden opgemerkt dat geneste PCR vertekende resultaten geven als een paar intact templates bijdragen aan het amplificatieproces. Primerparen die specifiek zijn voor de gewijzigde amplicon moeten worden ontworpen, hun sequenties niet bevatten CpG dinucleotiden om methylering voorgespannen versterking te vermijden. Bovendien moet primers bevatten niet CpG cytosines om amplificatie van ongemodificeerde of onvolledig omgezet DNA voorkomen. Versterking van een aantal templates kunnen baat hebben bij het uitvoeren van Hot-start PCR. In ieder geval dient geschikt primerparen worden gecontroleerd modelexperimenten teneinde bederf van waardevolle experimentele monsters voorkomen. Bisulfiet sequencing is een standaard methode voor het site-specific methylatie analyse als het in staat om betrouwbaar en nauwkeurig opsporen van de methylatie van CpG enkele residuen in een allel-specifieke manier 8. Direct sequencing van het PCR-product wordt niet aangeraden als gemengde methylatie oFA CpG residu wordt weergegeven als een C / T dubbele piek in de elektroferogram, die kwantificering van methylering kan voorkomen dat op het betrokken gebied. Daarom een ​​tussenproduct klonen stap wordt uitgevoerd en verschillende klonen worden gesequenced (~ 20-30) om de mate van methylering bepalen. Pyrosequencing is een alternatieve methode om DNA-methylatie te kwantificeren. Het maakt ook gebruik van bisulfiet conversie en bisulfiet PCR maar in plaats van het klonen en de volgorde van de amplicon wordt onderworpen aan een directe pyrosequencing reactie waarbij de methylatie status van een CpG residu wordt gelezen als een C / T single nucleotide polymorfisme die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Beide methoden te sporen hetzelfde niveau van methylatie 9, maar sinds het klonen-stap kan worden overgeslagen pyrosequencing meer tijd-efficiënt. Afhankelijk van het sjabloon 40 tot 100 nucleotiden keer kan worden gesequenced zodat meerdere rondes van Pyrosequencing verschillende sequencing primer noodzakelijk. Dit is een kritieke beperking, gegeven that grotere hoeveelheden DNA (ongeveer 1 ug per reactie) nodig zijn, die voorzienbaar meer bedragen dan de bedragen die beschikbaar zijn van de kleine hersenweefsel stoten. Zo eerste aftasten van gebieden in het bereik van enkele kilobasen door Pyrosequencing weergegeven minder geschikt als enkele kloon lezen. Niettemin moet na de identificatie van een klein gebied van belang pyrosequencing beschouwd. Collectief, het protocol dat hierboven beschreven biedt een nauwkeurige, efficiënte en gestroomlijnde aanpak voor de snelle en kosteneffectieve analyse van de hersenen micropunches voor epigenetische veranderingen. Meerdere exemplaren kunnen worden verwerkt in een enkele run en de methoden geschikt zijn bij het uitvoeren van steekproeven uit intermediaire-en kleinbedrijf experimenten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.955,50 </td></tr><tr><td> Epitect bisulfiet Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743.100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sequencing Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq polymerase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

Blootstelling aan voeding, kan drugs en ​​het vroege leven tegenslag tijdens gevoelige ramen van het leven 1,2 leiden tot blijvende veranderingen in genexpressie die bijdragen aan de weergave van fysiologische en gedragsmatige fenotypes. Dergelijke milieu-programmering is waarschijnlijk de gevoeligheid te verhogen tot metabolische, cardiovasculaire en psychische aandoeningen 3,4. DNA-methylatie en histon modificaties worden beschouwd als de belangrijkste processen in de bemiddeling van de gen-omgeving dialoog en lijken ook voor het milieu programmering ten grondslag 5. In zoogdieren, DNA methylering omvat typisch de covalente toevoeging van een methylgroep aan de 5-plaats van cytosine in het kader van CpG dinucleotiden. CpG methylering plaatsvindt in een zeer weefsel-en cel-specifieke manier waardoor het een uitdaging om discrete, kleine gebieden van de hersenen waar cellulaire heterogeniteit is hoog en de hoeveelheid weefsel beperkt te bestuderen. Bovendien banwege genexpressie en methylatie zijn nauw met elkaar verbonden gebeurtenissen, kan meer waarde worden verkregen door het vergelijken van beide parameters in hetzelfde monster. Hier wordt een stap-voor-stap protocol (figuur 1) voor het onderzoek van epigenetische programmering in de hersenen gepresenteerd met behulp van de &#39;scheiding van de moeder&#39; paradigma van het vroege leven tegenslag voor illustratieve doeleinden. Het protocol beschrijft de bereiding van micropunches van verschillend leeftijd muis hersenen van waaruit DNA en RNA tegelijk kunnen worden geïsoleerd, waardoor DNA-methylatie en genexpressie analyses in hetzelfde monster.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaxische Chirurgie voor excitotoxische laesie van specifieke hersengebieden in de Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...