Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי ממכון מקס פלנק לפסיכיאטריה מארי האיחוד האירופי רשת קירי ההכשרה הראשונית (חוזה NINA 238665).

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תכנות epigenetic מוכרת יותר ויותר לבריאות מנגנון חשוב הבסיס לבין המחלה. כאן אנו מציגים שיטה מעודנת לבידוד בו זמנית של DNA ו-RNA מ micropunches ואת הצעדים הבאים כדי לקבל פרופילים מתילציה דנ&quot;א באמצעות רצף bisulfite. עבודה אופטימיזציה מאפשר ניתוח נוח של תכנות epigenetic במוח בתגובה לגירויים סביבתיים. יתר על כן, גישה זו מקלה על חקירת הקשר הפונקציונלי בין מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים כמו גם מנותחים מדגם זהה. לבסוף, מספר בעלי החיים הדרושים לניסוי ניתן לצמצם באופן משמעותי. אמצעי זהירות מסוימים והנחיות חייבות לבוא בעת ביצוע העבודה שהוצג. בהתחשב במורכבות יוצאת דופן ההטרוגניות של המוח ומאז דפוס מתילציה והביטוי עשויה להשתנות באופן תאים ורקמות ספציפי זה של מירבכי micropunching חשיבות מתבצע בצורה סטנדרטית. כמו במקרה של הנקודה, תכנות epigenetic של AVP מתגלה paravaventriuclar, אבל לא בגרעין supraoptic (איור 4 ב &#39;, ד), 2 AVP להביע אזורי ההיפותלמוס 4. מבחינה זו, הזמינות של DNA ו-RNA של אגרוף רקמות זהה יש יתרון ביטוי RNA של גנים מסוימים ברקמות ספציפיות סמן יכול לשמש במקרים מסוימים לאשר כי השטח הנכון היה אגרוף. למרות micropunching יכול להפחית ההטרוגניות הסלולר, הוא צריך לזכור כי גישה זו אינה מובילה לבידודה של סוגי תאים בודדים או אוכלוסיות. צעדים נוספים טיהור עשוי להיחשב לטפל בנושא זה. עבור bisulfite רצף עיצוב פריימר האופטימלי לטיפול PCR bisulfite הבאה הגברה חיוני. מוצרי ה-PCR העולה על 400 נ&quot;ב באורך עלולה להיות בעייתית בשל הידרדרות של ה-DNA על ידי בisulfite הטיפול. יש לציין גם כי ה-PCR מקונן יכול לתת תוצאות מוטות אם רק כמה תבניות שלמות כמה לתרום לתהליך ההגברה. זוגות פריימר ספציפיים עבור amplicon שונה צריך להיות מתוכנן, רצפים שלהם לא יכילו dinucleotides CPG על מנת למנוע מתילציה מוטות הגברה. בנוסף, primers צריך להכיל לא CPG cytosines כדי למנוע הגברה של DNA ללא שינוי או המרה באופן חלקי. הגברה של מספר תבניות עשויות להפיק תועלת בניהול חם תחילת PCR. בכל מקרה, התאמת זוגות פריימר צריך להיות מאומת בניסויים הטייס כדי למנוע קלקול של דגימות ניסויים חשובים. סידור bisulfite מייצג שיטה סטנדרטית לניתוח באתר מתילציה ספציפי כפי שהוא מסוגל לזהות באופן אמין ומדויק מתילציה של שאריות CPG יחיד באופן אלל ספציפי 8. רצף ישיר של מוצר ה-PCR לא מומלץ, היות מתילציה o מעורבתשאריות fa CPG יופיעו השיא C / T כפול electropherogram, אשר יכול למנוע כימות של מתילציה באתר מודאג. מסיבה זו הצעד שיבוט ביניים מבוצע שיבוטים כמה הם רצף (~ 20-30) כדי לקבוע את מידת מתילציה. Pyrosequencing מייצג שיטה חלופית לכמת מתילציה בדנ&quot;א. הוא גם מנצל ההמרה bisulfite ו bisulfite PCR אבל במקום השיבוט רצף amplicon נתונה התגובה pyrosequencing ישיר, שבו מצב מתילציה של שאריות CPG נקרא פולימורפיזם כמו C / T נוקלאוטיד יחיד, שניתן לכמת בקלות. שתי השיטות לזהות רמות דומות של מתילציה 9 אבל מאז שיבוט שלב ניתן להשמיט pyrosequencing יותר זמן יעיל. עם זאת, בהתאם לתבנית רק 40-100 נוקלאוטידים יכול להיות רצף בבת אחת, כך מספר סבבי pyrosequencing עם פריימר סידור שונה נחוצים. זוהי מגבלה קריטית, בהתחשב thaסכומים לא גבוהים יותר של ה-DNA (כ 1 מיקרוגרם לכל תגובה) נדרשים, דבר הנראה לעין יעלה על הסכומים הזמינים מן המכות רקמה זעירים במוח. כך סריקה ראשונית של אזורים בטווח של כמה kilobases ידי pyrosequencing נראה פחות מתאים כמו קריאה שיבוט אחד. אף על פי כן, לאחר זיהוי על אזור קטן של pyrosequencing עניין יש לשקול. באופן קולקטיבי, את הפרוטוקול המתואר לעיל מספק גישה מדויק, יעיל יעיל לניתוח מהיר וחסכוני של micropunches המוח לשינויים epigenetic. דגימות מרובות ניתן לעבד בטווח אחת השיטות מתאימות בזמן הרצת דגימות ביניים בגודל ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> דם DNeasy &amp; ערכת רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740,955.50 </td></tr><tr><td> Epitect ערכת bisulfite </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin חלץ </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740,609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T וקטור שיבוט Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-נגל </td><td> 743,100.50 </td></tr><tr><td> מונטאז רצף 96 ניקוי </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar פולימראז Taq </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq פולימראז </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

חשיפה דיאטה, תרופות מצוקות החיים בשלב מוקדם של Windows רגישים של 1,2 החיים יכולים להוביל לשינויים בר קיימא ביטוי גנים התורמים התצוגה של פנוטיפים פיזיולוגיים והתנהגותיים. תכנות סביבתי כזה עלול להגביר את הרגישות, מחלות מטבוליות לב וכלי דם הנפש 3,4. מתילציה דנ&quot;א שינויים היסטון נחשבים תהליכים מרכזיים בגישור של דיאלוג גנים הסביבה ומופיעות גם רובד תחתון תכנות הסביבה 5. אצל יונקים, מתילציה בדנ&quot;א בדרך כלל כוללת בנוסף קוולנטי של קבוצת מתיל במיקום-5 של ציטוזין בהקשר של dinucleotides CPG. מתילציה CPG מתרחשת באופן רקמות ותאים ספציפי מאוד מה שהופך אותו לאתגר ללמוד בדידים, אזורים קטנים של המוח שבו ההטרוגניות הסלולר הוא גבוה וכמות הרקמה מוגבלת. יתר על כן, בביטוי גנים מתילציה ecause ו מתקיים קשר הדוק אירועים, ערך מוגבר ניתן להשיג על ידי השוואת שני הפרמטרים במדגם זהה. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד (איור 1) לחקירה של תכנות epigenetic במוח מוצג באמצעות פרדיגמה &quot;הפרידה מן האם&quot; צרה חייו המוקדמים לשם המחשה. הפרוטוקול מתאר את הכנת micropunches של מוחות עכבר דיפרנציאלי בגיל שממנו DNA ו-RNA יכול להיות מבודד בו זמנית, ובכך מאפשר מתילציה בדנ&quot;א וביטוי גנים ניתוחים במדגם זהה.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ&quot;א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...