Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
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この作品は、精神医学のマックスプランク研究所と欧州連合（EU）のマリー·キュリー初期研修ネットワーク（NINA契約238665）によって資金を供給された。

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	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

エピジェネティックなプログラミングがますます重要なメカニズムの基礎となる健康と病気として認識されています。ここでは、micropunchesと亜硫酸塩シークエンシングによってDNAメチル化プロファイルを取得するために後続の手順からDNAとRNAの同時分離のための洗練された手法を提案する。最適化されたワークフローは、環境刺激に応答して、脳内のエピジェネティックなプログラミングの便利な分析を行うことができます。また、このアプローチは、両方が同じサンプルから分析されるDNAメチル化と遺伝子発現との間の関数関係の調査を容易にします。最後に、実験に必要な動物数を大幅に削減できます。 提示したワークフローを実行中に特定の注意事項およびガイドラインに従う必要があります。メチル化と発現パターンは細胞および組織特異的に変わることがありますので、特別な複雑さと脳の異質性を考慮し、それが最高のものですmicropunchingが標準化された方法で行われることの重要性。ポイントのケースとして、AVPのエピジェネティックなプログラミングがparavaventriuclarではなく、視索上核（ 図4b-d）は、視床下部4の2 AVP発現している地域で検出されます。この点では、同じ組織のパンチからDNAとRNAの可用性は、RNAの特定の組織特異的なマーカー遺伝子の発現を正しい領域がパンチされたことを証明するいくつかのケースで使用することができるように有利である。 micropunchingは、細胞の不均質性を減らすことができますが、このアプローチは、単一の細胞型または集団の分離につながるものではないことを覚えなければなりません。追加の精製工程は、このトピックに対処するために考えられるかもしれません。 亜硫酸塩は亜硫酸水素塩処理後のPCR増幅のための最適なプライマー設計をシークエンシングのために不可欠です。長さは400 bpを超えるPCR産物はbでDNAの分解に起因する問題が発生することができisulfite処理。また、わずかそのままテンプレートには、増幅過程に寄与する場合は、入れ子になったPCRは、偏った結果を与えることができることに留意すべきである。変更されたアンプリコンに特異的なプライマーペアを設計する必要があります。その配列はメチル化バイアスの増幅を避けるために、CpGジヌクレオチドを​​含むべきではありません。さらに、プライマーは修飾されていない、または不完全に変換されたDNAの増幅を防ぐために、非CpGのシトシンを含める必要があります。いくつかのテンプレートの増幅にはホットスタートPCRを実施して恩恵を受ける可能性があります。貴重な実験試料の損傷を防止するためにどのような場合には、プライマーペアの適合性は、パイロット実験で検証する必要があります。 それが確実かつ正確にアレル特異的に8つのCpGの残基のメチル化を検出することができるように亜硫酸シークエンシングは、サイト固有のメチル化解析のための標準的な方法を表しています。 PCR産物のダイレクトシークエンシングは、混合メチル化Oとしてお勧めできませんFA化CpG残基は、当該サイトでのメチル化の定量化を防ぐことができる電気泳動におけるC / T、ダブルピークとして表示されます。この理由のために中間のクローニングステップが行われ、いくつかのクローンを配列決定されている（〜20から30）メチル化の程度を決定する。パイロシーケンシングではDNAメチル化を定量化するための代替メソッドを表します。また、亜硫酸水素塩変換と亜硫酸PCRではなく、クローニングおよびアンプリコンは、CpGの残基のメチル化状態を容易に定量化することができるC / Tの一塩基多型として読まれ、直接パイロシークエンシング反応に供されているシーケンスを利用しています。どちらの方法でも、メチル化9の類似のレベルを検出するがクローニングステップを省略することができるので、パイロシーケンシングでは、より多くの時間が効率的です。ただし、テンプレートに応じてのみ40から100ヌクレオチドが異なるシークエンスプライマーを用いてパイロシーケンシングのいくつかのラウンドが必要であるように一度配列を決定することができます。これは、股関節を考えると、重要な制限事項です。DNAのtより高い量（反応当たり約1μg）を小さな脳組織のパンチから利用可能額を超える予見され、必要とされています。したがって、パイロシーケンシングで数キロの範囲内の領域の最初のスキャンは、単一のクローンの読みとしてはあまり適して表示されます。それにもかかわらず、金利のパイロシーケンシングの小さな領域の識別に以下を考慮する必要があります。 総称して、上記のプロトコルは、エピジェネティックな変化の脳micropunchesの迅速かつ費用対効果分析のために、正確に効率的かつ合理的なアプローチを提供します。複数の標本は、単一の実行で処理し、中間サイズの実験からのサンプルを実行するときの方法が適していることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DNeasy血液·組織キット</td><td>キアゲン</td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td>マシュレ·ナーゲル</td><td> 740955.50 </td></tr><tr><td>亜硫酸キットのプロトコールとトラブルシューティング</td><td>キアゲン</td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospinエキス</td><td>マシュレ·ナーゲル</td><td> 740609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-Tベクタークローニングキット</td><td>プロメガ</td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td>マシュレ·ナーゲル</td><td> 743100.50 </td></tr><tr><td>モンタージュ96シーケンスのクリーンアップ</td><td>ミリポア</td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taqポリメラーゼ</td><td>キアゲン</td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taqポリメラーゼ</td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

食事療法への曝露は、人生の1,2の敏感な窓の間に薬剤および初期生活逆境は、生理学的および行動表現型のディスプレイに寄与する遺伝子発現の持続的な変化につながる可能性があります。そのような環境のプログラミングは、代謝、心血管疾患および精神疾患3,4に対する感受性を増加させる可能性があります。 DNAメチル化とヒストン修飾は、遺伝子と環境の対話の仲介に主要なプロセスを考慮し、環境のプログラミング5アンダーレイにも表示されています。哺乳類では、DNAメチル化は通常CpGジヌクレオチドのコンテキスト内でのシトシンの5位のメチル基の共有結合的付加を有する。 CpGメチル化は細胞の不均質性が高く、組織の量が制限され、脳の離散的な、小さな領域を研究するために挑戦すること非常に組織および細胞特異的に発生します。また、Because遺伝子発現とメチル化が密接にリンクされているイベントは、増加値は、同じサンプルで両方のパラメータを比較することによって得ることができる。 ここでは、脳内のエピジェネティックなプログラミングの調査のためのステップバイステップのプロトコル（ 図1）は 、例示目的のために初期生活逆境の&quot;母子分離&quot;パラダイムを使用して提示されます。プロトコルは、このように、同じサンプル中のDNAメチル化と遺伝子発現解析を可能にする、DNAおよびRNAを同時に分離することができ、そこから差動高齢マウスの脳からmicropunchesの準備について説明します。

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Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現の変化の解析

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...