Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Max Planck Institute of Psychiatry og EUs Marie Curie Initial Training Network (NINA Kontrakt 238665).

1. Programmering av Tidlig Life Motgang Maternal separasjon (MS) er utført for å indusere tidlig liv stress (ELS) i unger levert av tidsstyrt-gravide C57BL/6N mus (postnatal dag 0 (P0) på dag for fødsel). <ol><li> Individuelle kull er plassert i rene bur (med oppvarming pad) for 3 t daglig fra P1-10. </li><li> Kontroll (ikke-ELS) unger forblir uforstyrret i mors reiret gjennom. </li><li> Valper blir holdt sammen med sine mødre til avvenning (P21), etter hvilken tid de er plassert i sex-matchede grupper (3-5 mus pr bur) under standard forsøksdyr boforhold. </li></ol> 2. Isolering og Dissection av hjernevev <ol><li> Mus blir drept på ønskede alder av livmorhalskreft forvridning Merk:. Fordi denne protokollen innebærer et stress paradigme, er ingen anestesi gis før cervical forvridning, for å unngå å forstyrre normal fysiologisk regulering av stresshormoner. Skallen er åpnet oghjerner er omhyggelig fjernet og straks snap-frosset ved nedsenkning i iso-pentan-tørris, før de ble lagret ved -80 ° C. </li><li> Hjerner er cryosectioned (10 mikrometer tykkelse); delene er montert på Superfrost glassplater og vedlikeholdt ved -20 ° C. Henvisning til en standard mus stereotaxic atlas (f.eks Paxinos 6) brukes for å verifisere anatomiske presisjon og for å sikre inkludering av regionen av interesse (f.eks for nevroner i paraventricular kjernen - PVN - samle seksjoner start på nivået av rostral PVN, bregma -0,75 til -0,85). </li><li> Seksjonene er farget med cresyl fiolett å lette identifikasjon av ulike strukturer i hjernen. Punches (0,8 mm) av regionene av interesse (f.eks PVN) er fremstilt av i Loco mikrodisseksjon. </li></ol> 3. Nukleinsyre Utvinning fra Brain Punches En optimalisert protokoll for samtidig å trekke ut DNA og RNA fra små neuroanatomically definert hjerne regioner for bisulfite og genekspresjon analyser er beskrevet 7. Merk: Tatt i betraktning at RNA er mindre stabilt enn DNA i GTC-buffer, anbefaler vi behandler RNA først. Den homogenat brukes for DNA rensing kan oppbevares i romtemperatur (RT) i løpet av den tiden. <ol><li> Homogenisere slag ved hjelp av en pipette og vortexer i 400 mL av guanidinium thiocyanate (GTC) buffer (4,5 M guanidinium thiocyanate, 2% N-lauroylsarcosine, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl 7,5 pH, 0,1 M beta-mercaptoethanol, 0,2% Antifoam A) på RT, passerer flere ganger gjennom en sprøyte sprøyte (29G) (figur 2). </li><li> Split lysate i like deler, både RNA og DNA kan tas ut samtidig eller separat, avhengig av spesielle eksperimentelle behov. </li><li> For RNA rensing legg 1/10 volum av NaOAc, en volum AquaPhenol (Appligene) (pH 4) og 1/2 volum av kloroform: isoamyl (24:1) til lysate. Vortex kraftig etter hvert trinn oginkuberes på is i 10 min, sentrifuger (20 min ved 10 000 g ved 4 ° C), tilsett en tilsvarende volum på 70% EtOH til aequous fase. </li><li> Overfør blandingen til en RNA spin kolonne (f.eks Nucleospin RNA II fra Macherey-Nagel) og utføre on-kolonne DNase-fordøyelse og vask trinn (Følg produsentens protokoll); Eluer RNA i 25 mL H 2 O. </li><li> For DNA rensing en optimalisert protokoll av Qiagen DNeasy blod og vev Kit brukes. Stabilisere lysate med like mengder Buffer AL og 100% EtOH, belastning på en Spin Column sentrifuge (1 min ved 10 000 g ved RT) og forkaste gjennomstrømning. </li><li> Legg til 500 mL buffer AW1 inkludert 5 mL RNase (1 mg / ml) til kolonne og inkuber 10 min ved RT. Spin (1 min ved 10 000 g, RT) og forkaste gjennomstrømning. </li><li> Vask kolonnen med 500 mL buffer AW2, forkaste gjennomstrømning og sentrifugeres tom kolonne (1 min ved 15 000 g). </li><li> Legg prewarmed (70 ° C) buffer AE og inkuber kolonner for 10 minutter ved 70 ° C. Eluer ved sentrifugering (1 min, 10000 g), re-søke gjennomstrømning og gjenta sentrifugering trinn. </li></ol> Bruk et spektrofotometer å bestemme DNA og RNA konsentrasjoner. En typisk PVN slag avlinger ~ 600 ng DNA og ~ 400 ng RNA. For genekspresjonsanalyse av kvantitativ PCR (qPCR), vi bruker vanligvis ~ 100 ng av RNA i revers transkripsjon reaksjon. 4. Bisulfite Konvertering Natrium bisulfite brukes til å konvertere ikke-denaturert cytosines til uracils. I kontrast er denaturert cytosines beskyttet mot konvertering. Derfor er alle cytosines som påvises i den endelige sekvensering av bisulfite PCR-fragment representerer denaturert cytosines. Bisulfite konvertering forårsaker betydelig DNA degradering som kan være en begrensende faktor i PCR-analyse. Optimaliserte reaksjons forhold som maksimerer cytosin konvertering, redusere DNA fragmentering og vedlikeholde enkelttrådet DNA selv ved lavere temperaturer kan oppnås ved hjelpQiagen har EpiTect bisulfite Kit. I våre hender ~ 200 ng av DNA renset fra micropunches gi en tilstrekkelig mengde utgangsmaterialet for bisulfite reaksjonen. For å hindre forskjeller i effektiviteten av konverteringen reaksjon, bør mengden av malen DNA holdes konstant blant alle prøvene som ble prosessert i løpet av et eksperiment. I tillegg leser sekvens bør gransket for konvertering effektivitet ved å undersøke andelen av ikke-konverterte ikke-CpGs. Denne satsen bør overstige 98%. Lavere verdier indikerer ufullstendig eller ineffektiv bisulfite konvertering og de underliggende sekvenser bør utelukkes fra analysen. 5. Bisulfite PCR <ol><li> Design bisulfite sekvensering primere som er spesifikke for bisulfite konvertert DNA (se diskusjon); Methyl Primer Express-programvaren ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ No / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602 121) vil hjelpe dette og bidra til å fastslå optimale annealing temperaturer i pilot forsøk. </li><li> Forbered PCR-Master-Mix (for en reaksjon) som følger: 2,5 mL 10x PCR buffer 0,5 mL 10 mm dNTPs 1 mL 10 mm forward primer 1 mL 10 mM revers primer 0,125 mL Qiagen Hotstart Taq Plus fyll opp til 23 mL med H 2 O </li><li> Tilsett 2 mL bisulfite behandlet DNA til reaksjonen. </li><li> Forsterke hjelp av følgende vilkår: En syklus 6 min 95 ° C 45-50 sykluser med 1 min 95 ° C, 1 min ved optimal annealing temperatur, 1 min 72 ° C En syklus 5 min 72 ° C </li></ol> Analyser 7 mL av PCR produktet ved agarose gel elektroforese å bekrefte størrelsen på fragment og rense de resterende PCR reaksjonen for påfølgende ligation hjelp av en kommersielt tilgjengelig PCR Clean-up kit (f.eks Macherey-Nagel Nucleospin Pakk). I tilfelle flere uønskede PCR produkter er fremstilt, er gel rensing anbefales. 6. Bisulfite Sekvensering Høyoppløselige DNA metylering profiler utledet fra enkle klone avlesninger kan oppdage små forandringer i DNA metylering og identifisere regulatoriske regioner som er mottagelig for behandling (miljømessig programmering). Den bisulfite sekvensering Prosessen består av tre sammenhengende arbeidsforhold trinn. For det første er PCR-produkter fremstilt ved tidligere bisulfite PCR ligated inn en vektor og forvandlet til bakterier. For det andre koloni PCR fra enkle kloner ansatt for å bestemme riktig størrelse på innsatsen. For det tredje er positive koloni PCRs ryddet opp og utsatt for Big-Dye sekvensering reaksjon. Etter en opprydding trinn, er produkter electrophoresed på en kapillær sequencer. 6,1 ligation og Transformation Merk: Vi rutinemessig bruker pGEM-T vector cloning kit (Promega). I vår erfaring, avhenger kloning effektivitet kritisk på innsatsen som skal ligated. Ulike vektorer bør testes i tilfelle lavt antall rekombinante klonene er gjentatte ganger innhentet. <ol><li> Sett opp ligation reaksjon: 5 mL 2x hemorroider Buffer 1 mL pGEM-T Vector 1 mL T4-ligase 3 mL ryddet opp PCR produkt </li><li> Bland reaksjon ved pipettering og inkuber over natten ved 4 ° C. Merk: hemorroider kan også utføres i 1 time ved RT også. Å øke antall rekombinante kloner, over natten ligation ved 4 ° C er å foretrekke. </li><li> Opprydding av ligation produkt til etanol nedbør: <ol class="lalpha"><li> Legg en mL glykogen, en mL 3M NaAc og 25 mL 100% EtOH til ligation reaksjonen og bunnfallet i 1 min i flytende nitrogen. </li><li> Sentrifuger (15,0000 gr i 30 min ved 4 ° C) og kast supernatanten. </li><li> Vask med 300 mL70% EtOH og sentrifuger (15 000 g for 20 min ved 4 ° C), kast supernatanten og tørr pellet på RT (10 min). </li><li> Resuspender pellet i 10 mL H 2 O. </li></ol></li></ol> 6.2 Transformasjon av ligation produkter i electrocompetent bakterier <ol><li> Precool electroporation kyvetter (1 mm bredde) på isen og tine delmengde av electrocompetent DH5α bakterier på is. </li><li> Legg 45 mL DH5α bakterier til 10 mL ryddet opp ligation produktet (se ovenfor), og overføre til kyvetten. </li><li> Transform bakterier på 1,5 kV, 200 Ω, 15 μF og tilsett 1 ml prewarmed SOB medium direkte etter puls levering. </li><li> Recover bakterier i 1 time ved 37 ° C, spre 100 mL av suspensjon på LB / ampicillin platene belagt med IPTG / X-Gal. </li><li> Inkuber platene over natten ved 37 ° C. </li></ol> 6,3 Colony PCR Merk: Colony PCR fra enkeltrom kloner er gjennomført for å sikre at innstikk erav forventet størrelse. Forsinket farge utvikling fra den blå / hvite screening, uønskede rekombinasjon hendelser under ligation, innlemmelse av oligomeric primer par eller avkortet PCR produktene ellers føre til defekte sekvensering resultater. Vi rutinemessig bruker T7 og SP6 primere til forsterke klonede innstikk; dette resulterer i ekstra vektor sekvenser på ca 150 bp. T7 primer brukes i sekvensering reaksjonen i et senere trinn. <ol><li> Sett opp kolonien PCR reaksjon i 96-brønn plate. For en reaksjon bruke: 3 mL 2,5 mM MgCl 2 2,5 mL 10x Taq buffer 1,5 mL 10 mM dNTP 2 mL 2,5 mM T7 primer 2 mL 2,5 mM SP6 primer 1 mL Fermentas Taq Polymerase fyll opp til 25 mL med H 2 O </li><li> Tilsett 25 mL / godt av master mix i hver brønn av en 96-brønns plate. </li><li> Plukk positive (hvit) klone fra plate med pipettespissen og dukkert i PCR reaksjonen. </li><li> Forsterke bruker FOLfølger følgende vilkår: En syklus 4 min ved 95 ° C 10 sykluser 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 56 ° C og 30 s ved 72 ° C 30 sykluser 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 48 ° C og 30 s ved 72 ° C En syklus 5 min ved 72 ° C </li><li> Belastning 5 mL av kolonien PCR på en agarose gel og bestemme reaksjoner som inneholder riktig innsatsen størrelse. </li><li> Colony PCRs inneholder de ønskede amplikonene blir ryddet opp med en kommersielt tilgjengelig kit (Machery Nagel Nucleofast). </li></ol> 6.4 Big-Dye terminator reaksjon og sekvensering <ol><li> Forbered Master mix for Big-Dye reaksjon. For en reaksjon bruke: 1 mL H 2 O 0,5 mL Big-Dye reagens 1,5 mL Sekvensering buffer </li><li> Tilsett 3 mL / brønn i hver brønn av en 96-brønns plate, til hver brønn tilsett 2 mL av ryddet opp koloni PCR produkt og kjøre reaksjon på en thermocycler med følgende parametere: 35 sykluser med 10 s ved 96 ° C, 5 s ved 50 ° C og 4 min ved 60 ° C </li><li> The Big-Dye reaksjon er ryddet opp med en kommersiell kit (Millipore Montage 96 Sekvensering Clean-Up Kit) og behandlet på en kapillær sequencer (f.eks ABI 3100 DNA). </li><li> Sekvenser blir analysert ved hjelp av BIQ Analyzer ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) eller den elektroniske verktøyet BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) å utlede metylering mønster av den undersøkte DNA-regionen (figur 4). </li></ol> 7. Representative Resultater For å få innsikt i påvirkning av ELS på AVP uttrykk og metylering status, ble C57BL/6N mus behandlet i henhold til arbeidsflyten beskrevet ovenfor. Kort, var en gruppe C57BL/6N mus subjected til ELS mens kontrollgruppen ble etterlatt uforstyrret. Den PVN og supraoptic nucleus (SON) ble slått og DNA og RNA ble isolert samtidig fra de enkelte slagene. RNA ble omvendt transkribert og nivåene av AvP vitnemål ble målt ved qPCR analyse og normalisert til uttrykk av hprt og Gapdh housekeeping gener. DNA var bisulfite behandlet, forsterket med primere spesifikke for AVP enhancer (figur 4a) og PCR produktene ble klonet og sekvensert. Minst 20 rekombinante klonene fra hver mus / PCR ble analysert for å fastslå metylering frekvenser for de CpGs finnes i PCR fragment (figur 4b). Sammenlignet med kontroller, ELS induserte en signifikant hypomethylation på CpG10, CpG12, CpG13 og Cpg14 av AVP enhancer (p &lt;0,05, n = 6-8 dyr) tyder epigenetic merking av dette regelverket regionen gjennom tidlig livserfaringer. I motsetning til PVN, metylering avAVP enhancer var upåvirket av ELS i SON illustrerer vev spesifisitet epigenetic merking (figur 4c). Analyse av DNA metylering status på CpG10 og AvP genuttrykk i kontroll dyr (n = 6) dokumentert en negativ korrelasjon peker til en rolle DNA metylering i finjustering av AVP genuttrykk (figur 4d). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Figur 1. Micropunches er hentet fra dissekerte hjerner fra kontroll-og tidlig-life stresset mus. Etter DNA og RNA isolering, er genekspresjon bestemmes av Qrt-PCR mens bisulfite behandles DNA forsterkes og rensede produkter er klonet i en egnet vektor slik at identifisering av rekombinante klonene av blå / hvit valg. Feil insert størrelser er verifisert avkoloni PCR før utføring av Big-Dye reaksjon og prosessering på en kapillær sequencer. Metylering mønster er visualisert ved hjelp av egnede dataverktøy. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figur 2. Timeline fra DNA / RNA ekstraksjon til bisulfite sekvensering. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figur 3. Arbeidsflyt for samtidig utvinning av DNA og RNA. Slaget av hypothalamus kjernen paraventricularis, en liten AvP gen uttrykker hjernen regionen, er plassert i 400 mL GTA buffer, vortexed inntil avbrutt og videre homogenisert ved å passere gjennom en sprøyte (29G). Den homogenat er deretter delt for rensing av RNA og DNA. Delingen kan være 1:1 eller av ulike proporsjoner avhengigpå en bestemt eksperimentelle spørsmålet. Homogenat bør behandles i løpet av noen timer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figur 4. CpG metylering ved AVP locus i seks uker gammel kontroll og ELS dyr. (A) Scheme av AVP og oxytocin gener orientert halen til halen og atskilt av intergenic region (IGR). Eksoner er avbildet med åpne (nummererte) bokser. Fordelingen av CPG rester indikeres og størrelse og plassering av respektive PCR fragment inneholder CpG 10 til CpG14 er preget av en fet linje. (B) metylering av AvP enhancer i PVN i kontroll-og ELS dyr (n = 6-8). (C) metylering av AvP enhancer i SON i kontroll og ELS dyr (n = 8-10). (D) AvP genuttrykk var korrelertmed metylering ved CpG10 (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> .

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Epigenetic programmering blir stadig mer anerkjent som en viktig mekanisme bak helse og sykdom. Her presenterer vi en raffinert metode for samtidig isolering av DNA og RNA fra micropunches og påfølgende tiltak for å oppnå DNA metylering profiler gjennom bisulfite sekvensering. Den optimaliserte arbeidsflyten gir praktisk analyse av epigenetic programmering i hjernen som svar på miljømessige stimuli. Dessuten letter denne tilnærmingen etterforskningen av den funksjonelle sammenhengen mellom DNA metylering og genuttrykk som både analyseres fra samme prøve. Endelig kan antall dyr som trengs for forsøket bli betydelig redusert. Visse forholdsregler og retningslinjer skal følges mens du utfører presentert arbeidsflyten. Tatt i betraktning den ekstraordinære kompleksitet og heterogenitet av hjernen og siden metylering og uttrykk mønster kan variere i en celle-og vev bestemt måte det er av størstebetydning at micropunching blir utført på en standardisert måte. Som et eksempel på dette, er epigenetisk programmering av AvP oppdaget i paravaventriuclar, men ikke i supraoptic kjernen (Figur 4b-d), to AvP uttrykke regioner i hypothalamus 4. I denne forbindelse er tilgjengeligheten av DNA og RNA fra samme vev punsj fordel som RNA uttrykk for visse vev spesifikke markører gener kan brukes i noen tilfeller for å bekrefte at riktig området ble stanset. Selv micropunching kan redusere cellulær heterogenitet, må det bli husket at denne tilnærmingen ikke fører til isolasjon av single celletyper eller bestander. Ytterligere rensing skritt kan anses for å løse dette emnet. For bisulfite sekvensering optimal primer design for PCR amplifisering følgende bisulfite behandling er avgjørende. PCR-produkter som overstiger 400 bp i lengden kan være problematisk på grunn av nedbrytning av DNA ved bisulfite behandling. Det bør også bemerkes at nestet PCR kan gi tendensiøse resultater dersom bare noen få intakte maler bidra til forsterkning prosessen. Primer parene som er spesifikke for den modifiserte fragment skal utformes; deres sekvenser bør ikke inneholde CPG dinucleotides for å unngå metylering-partisk forsterkning. I tillegg bør grunnere inneholde ikke-CPG cytosines å hindre forsterkning av umodifisert eller ufullstendig konvertert DNA. Forsterking av enkelte maler kan ha nytte av å gjennomføre Hot-start PCR. I alle fall bør egnetheten til primer parene verifiseres i pilot forsøk å hindre at forringende av verdifulle eksperimentelle prøver. Bisulfite sekvensering representerer en standard metode for stedsspesifikk metylering analyse som det er i stand til pålitelig og nøyaktig oppdage metylering av single CPG rester i en allel-spesifikk måte åtte. Direkte sekvensering av PCR produktet er ikke anbefales som blandet metylering ofa CpG rester vil fremstå som en C / T dobbel topp i electropherogram, som kan hindre kvantifisering av metylering på stedet bekymret. Av denne grunn en mellomliggende kloning trinn er gjennomført og flere kloner blir sekvensert (~ 20-30) for å fastslå omfanget av metylering. Pyrosequencing representerer en alternativ metode for å kvantifisere DNA metylering. Det benytter også bisulfite konvertering og bisulfite PCR, men i stedet for kloning og sekvensering av fragment blir utsatt for en direkte pyrosequencing reaksjon der metylering status som CpG rester leses som en C / T single nukleotid polymorfisme som lett kan kvantifiseres. Begge metodene oppdage tilsvarende nivåer av metylering 9 men siden kloning-trinnet kan utelates pyrosequencing er mer tidseffektive. Men avhengig av malen bare 40-100 nukleotider kan bli sekvensert med en gang, slik at flere runder med pyrosequencing med forskjellig sekvensering primer er nødvendig. Dette er en kritisk begrensning, gitt that høyere mengder av DNA (ca 1 mikrogram per reaksjon) er påkrevd, som påregnelig overstiger de tilgjengelige beløpene fra bittesmå hjernevev slag. Dermed innledende skanning av regionene i størrelsesorden flere kilobases ved pyrosequencing synes mindre egnet som singel klone lesing. Likevel bør følge på identifisering av et lite område av interesse pyrosequencing vurderes. Samlet gir protokollen beskrevet ovenfor en nøyaktig, effektiv og strømlinjeformet tilnærming for rask og kostnadseffektiv analyse av hjernen micropunches for epigenetic endringer. Flere eksemplarer kan behandles i ett løp og metodene er egnet når du kjører prøver fra middels store eksperimenter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955,50 </td></tr><tr><td> Epitect bisulfite Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sekvensering Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq Polymerase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

Eksponering for kosthold, kan narkotika og tidlig liv motgang under sensitive vinduer i livet 1,2 føre til varige endringer i genuttrykk som bidrar til visningen av fysiologiske og atferdsmessige fenotyper. Slike miljø programmering er trolig å øke mottakelighet for metabolske, kardiovaskulære og mental sykdommer 3,4. DNA metylering og histonmodifikasjonene anses viktige prosesser i formidlingen av den gen-miljø dialog og vises også til underlag miljømessig programmering fem. I pattedyr, omfatter DNA metylering vanligvis kovalente tillegg av en metylgruppe på 5-posisjon cytosin innenfor rammen av CPG dinucleotides. CpG metylering oppstår i en svært vev-og celle-spesifikk måte å gjøre det en utfordring å studere diskrete, små områder av hjernen hvor mobilnettet heterogenitet er høy og vev kvantitet begrenset. Videre because genuttrykk og metylering er nært knyttet hendelser, kan økt verdi oppnås ved å sammenligne begge parametrene i samme prøve. Her er en steg-for-steg-protokollen (figur 1) for undersøkelse av epigenetic programmering i hjernen presenterte ved hjelp av &quot;mors separasjon &#39;paradigme av tidlig liv motgang veiledende. Protokollen beskriver utarbeidelse av micropunches fra differensielt-alderen mus hjerner som DNA og RNA kan samtidig isolert, og dermed gir DNA metylering og genuttrykk analyser i samme prøve.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

En strømlinjeformet arbeidsflyt for å studere DNA metylering og genekspresjon endringene på tidlig liv stress er vist. Fra mors separasjon av nyfødte mus og isolering av diskrete hjernen vev, representerer vi en protokoll til samtidig isolere DNA og RNA fra hjernevev slag for påfølgende bisulfite sekvensering og RT-PCR-analyse.

Optimalisert Analyse av DNA-metylering og Gene Expression fra små, anatomisk definerte områder i hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaxic Kirurgi for Excitotoxic lesjon i spesifikke hjerneområder i Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodisseksjon av anriket Bestander av neuroner eller Enslige nevroner for genekspresjonsanalyse etter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipulasjonsprosedyre av Gene Expression i voksen sebrafisk Brain hjelp Cerebroventricular Mikroinjeksjon av morpholino Oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse av Differential Gene Expression i elektroporerte Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Utarbeidelse av akutt hjernen skiver med en optimalisert N-Methyl-D-glucamine beskyttende gjenopprettingsmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...