Name: optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Эта работа финансировалась из Института Макса Планка по психиатрии и Мари Европейского союза Кюри Сеть по обучению (NINA контракта 238 665).

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Эпигенетическая программирования получает все большее признание в качестве важного механизма, лежащих в основе здоровья и болезни. Здесь мы приводим точный метод для одновременного выделения ДНК и РНК из micropunches и последующие шаги для получения профилей метилирования ДНК через бисульфит последовательности. Оптимизированный рабочий процесс позволяет удобно анализ эпигенетических программирования в мозге в ответ на стимулы окружающей среды. Кроме того, этот подход облегчает исследование функциональной взаимосвязи между метилирование ДНК и экспрессии генов, как и анализируются с того же образца. Наконец, поголовья скота, необходимых для эксперимента может быть значительно уменьшена. Некоторые меры предосторожности и руководящих принципов следует придерживаться при выполнении представлен рабочий процесс. Учитывая чрезвычайную сложность и неоднородность головного мозга и с метилирования и экспрессии могут варьироваться в клетку и ткань определенным образом это крайневажно, чтобы микроперфорацией производится в стандартном порядке. В качестве примера в момент эпигенетических программирования Avp обнаруживается в paravaventriuclar, но не в супраоптического ядра (рис. 4, б-г), два Avp выражения регионов гипоталамус 4. В связи с этим, наличие ДНК и РНК из той же ткани удара выгодно как РНК экспрессии определенных тканей конкретных генов-маркеров можно использовать в некоторых случаях для подтверждения, что правильное области был избит. Хотя микроперфорацией может уменьшить сотовой неоднородность, он должен помнить, что этот подход не приведет к изоляции отдельных типов клеток или групп населения. Дополнительные шаги очистки можно считать для решения этой теме. Для секвенирования бисульфит оптимального проектирования грунт для ПЦР-амплификации после лечения бисульфит имеет важное значение. ПЦР-продукты более 400 б.п. в длину может быть проблематичным из-за деградации ДНК бisulfite лечения. Следует также отметить, что ПЦР может дать результат, если предвзято только несколько шаблонов нетронутым свой вклад в усиление процесса. Грунтовка пар, которые являются специфическими для модифицированного ампликона должны быть разработаны, их последовательности не должны содержать CpG динуклеотиды во избежание метилирования смещением усиления. Кроме того, грунтовки должны содержать не-CpG цитозина, чтобы предотвратить усиление неизмененных или полностью преобразовать ДНК. Усиление некоторые шаблоны могут извлечь выгоду из проведения горячего старта ПЦР. В любом случае, пригодности пары праймеров должны быть проверены в пилотных экспериментов, чтобы предотвратить порчу ценных экспериментальных образцов. Бисульфит последовательность представляет собой стандартный метод для конкретных участков метилирования анализа, он способен надежно и точно обнаружить метилирования CpG одного остатков в аллель-специфической образом 8. Прямое секвенирование ПЦР-продукт не рекомендуется в качестве смешанного метилирования офа CpG остаток будет выглядеть как C / T двойного пика в electropherogram, который может предотвратить количественное метилирования на сайте обеспокоены. По этой причине промежуточный этап клонирования проводится и несколько клонов последовательность (~ 20-30), чтобы определить степень метилирования. Пиросеквенирования представляет собой альтернативный метод количественной метилирования ДНК. Он также использует преобразование бисульфит и бисульфит ПЦР, но вместо клонирования и секвенирования ампликонов подвергается прямой реакции пиросеквенирования где статус метилирования CpG остаток читается как C / T полиморфизм одного нуклеотида, которые могут быть легко определены количественно. Оба метода обнаружения такого же уровня метилирования 9, но так как клонирование шаг можно опустить пиросеквенирования более эффективный по времени. Однако, в зависимости от шаблона только 40-100 нуклеотидов может быть последовательность сразу, так что несколько раундов с различными пиросеквенирования грунтовка последовательности необходимо. Это является одним из важнейших ограничений, учитывая тхат большее количество ДНК (около 1 мкг на реакцию) не требуются, который обозримом превышать суммы можно получить крошечные удары ткани мозга. Таким образом, начальная проверка регионах в диапазоне от нескольких тысяч пар нуклеотидов по пиросеквенирования кажется менее подходит в качестве одного чтения клон. Тем не менее, следуя по определению небольшая область интереса пиросеквенирования должны быть рассмотрены. Совокупность описанных выше протокол обеспечивает точный, эффективный и рациональный подход для быстрого и экономически эффективного анализа мозг micropunches на эпигенетические изменения. Несколько образцов могут быть обработаны за один проход и методы пригодны при работе с образцами из среднего размера экспериментов.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> DNeasy крови и тканей Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin РНК II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955,50 </td></tr><tr><td> Epitect бисульфит Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Экстракт Nucleospin </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T векторного Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100,50 </td></tr><tr><td> Монтаж 96 Последовательность Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq полимеразы </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq полимераза </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

Воздействие диеты, лекарства и рано невзгоды жизни в чувствительных окна жизни 1,2 может привести к долгосрочным изменениям в экспрессии генов, которые способствуют проявление физиологических и поведенческих фенотипов. Такие экологические программы, скорее всего, увеличит чувствительность к метаболическим, сердечно-сосудистые и психические заболевания 3,4. Метилирования ДНК и гистонов модификации считаются ключевыми процессами в посредничестве генов и окружающей среды диалога и появляются также легли в основу экологической программы 5. У млекопитающих, метилирование ДНК обычно содержит ковалентные добавление метильной группы в положении 5 цитозина в рамках ди-CpG. CpG метилирования происходит в крайне образом ткани и клетки, что делает его конкретных задач для изучения дискретных, небольшой области мозга, где сотовая неоднородность ткани высокой и количество ограничены. Кроме того, бecause экспрессии генов и метилирования тесно связаны между собой событий, увеличилось значение можно получить, сравнивая оба параметра в одной пробе. Здесь шаг за шагом протокола (рис. 1) для изучения эпигенетических программирования в мозге представлены с использованием парадигмы &quot;материнской разделение&quot; раннего невзгоды жизни в иллюстративных целях. В протоколе описывается подготовка micropunches от дифференциально возраста мыши мозга, из которых ДНК и РНК, могут быть одновременно изолированы, таким образом позволяя метилирования ДНК и анализ экспрессии генов в одной пробе.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Рационализировать рабочий процесс изучения метилирования ДНК и изменениями экспрессии генов на ранних жизненных стрессов показано. Начиная с материнской отделение новорожденных мышей и изоляции дискретных тканях головного мозга, которые мы представляем протокол одновременно изолировать ДНК и РНК от ударов мозговой ткани для последующего секвенирования бисульфит и ПЦР-анализа.

Оптимизирован анализ метилирования ДНК и экспрессии генов с малым, Анатомически определенных областях мозга

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Изоляция Носовые Обонятельные стволовых клеток от грызунов и человека

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Стереотаксической хирургии эксайтотоксичного Поражение конкретных областей мозга в взрослых крыс

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Лазерная Capture Microdissection обогащенного популяции нейронов или отдельных нейронов для генного анализа выражения после черепно-мозговой травмы

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Микроманипуляция экспрессии генов в головном мозге взрослых данио рерио Использование церебровентрикулярных Микроинъекции олигонуклеотиды Морфолино

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Секвенирование РНК анализ дифференциальных экспрессии генов в электропорации Чик эмбрионального спинного мозга

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Анализ изменений экспрессии генов в гиппокампе крыс после глубокого мозга стимуляции передней ядра таламуса

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Подготовка фрагментов острого мозга, с помощью оптимизированного N-метил-D-glucamine защитные восстановления метод

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...