Name: detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Children&#39;s Discovery Institute subsidie ​​MC-II-2006-1 (RDM en TED), de NIH Epigenetica Roadmap subsidie ​​[1R01DA025744-01 en 3R01DA025744-02S1] (RDM en FLMV), U01AG023746 (SC), de Saigh Foundation (FLMV en TED), 1K08CA140720-01A1 en Alex&#39;s Lemonade Stand &quot;A&quot; Award ondersteuning (TED). Wij danken de Genome Technology Access Center bij de afdeling Genetica aan de Washington University School of Medicine voor hulp bij genomische analyse. Het centrum wordt gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Support Grant # P30 CA91842 aan de Siteman Cancer Center en door ICTS / CTSA Grant # UL1RR024992 van de NationalCenter voor onderzoek Resources (NCRR), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH), en NIH Roadmap for Medical Research. Deze publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van NCRR of NIH.

<ol>
	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Er is steeds meer bewijs dat de incidentie en de therapeutische respons van gemeenschappelijke, complexe fenotypes en ziekten zoals obesitas 8, hypercholesterolemie 4, hypertensie 7 en anderen kunnen worden gemodereerd door persoonlijke profielen van zeldzame variatie. Het identificeren van de genen en paden waar deze varianten aggregaat in de getroffen bevolking zal ingrijpende diagnostische en therapeutische implicaties, maar het analyseren van de betrokken personen afzonderlijk kunnen worden tijd en kosten te hoog. Populatie-gebaseerde analyse biedt een meer efficiënte methode voor het onderzoeken van genetische variatie op meerdere loci. We presenteren een nieuwe samengevoegde-DNA sequencing protocol gepaard met de SPLINTER softwarepakket ontworpen om dit soort van genetische variatie tussen populaties te identificeren. We tonen de nauwkeurigheid van deze methode bij het identificeren en kwantificeren van kleine allelen binnen een grote gepoolde populatie van 947 personen, waaronder zeldzame varianten die warende novo heet van de samengevoegde volgorde en gevalideerd door de afzonderlijke pyrosequencing. Onze strategie onderscheidt zich voornamelijk van andere protocollen door het opnemen van een positieve en een negatieve controle binnen elk experiment. Dit maakt SPLINTER te bereiken veel hogere nauwkeurigheid en kracht in vergelijking met andere benaderingen 1. De optimale behandeling van 25-voudig per allel is onafhankelijk van de grootte van het zwembad vast, zodat de analyse van grote groepen mogelijk dit vereiste alleen schalen lineair met de pool grootte. De benadering is zeer flexibel en kunnen worden toegepast op een fenotype van belang, maar ook monsters die van nature heterogene zoals gemengde celpopulaties tumorbiopsieën. Gezien de steeds toenemende belangstelling voor samengevoegde volgorde van grote doelgroep regio&#39;s zoals de exome of het genoom, onze bibliotheek prep en Splinter analyse is compatibel met op maat-capture en hele-exome sequencing, maar het hulpprogramma voor het uitlijnen van de SPLINTER pakket is niet ontworpen voor grootreferenties sequenties. Daarom hebben we met succes gebruik gemaakt van de dynamische programmering aligner, Novoalign, voor genoom-brede rooilijnen gevolgd door een variant noemen van de samengevoegde monster (Ramos et al.., Ingediend). Zo kan onze samengevoegd sequentie strategie succesvol schaal grotere groepen met toenemende hoeveelheden doelwitsequentie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Sectie </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betaïne </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vector </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Makkelijk </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> T4 polynucleotidekinase </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> T4 ligase </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polyethyleen Glycol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Bioruptor ultrasoonapparaat </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Zoals DNA sequencing technologie aanzienlijk uitgebreid in de laatste jaren twee, is het steeds duidelijker dat de hoeveelheid genetische variatie tussen twee personen groter dan eerder 3 gedacht. Daarentegen is array-gebaseerde genotypering niet tot een significante bijdrage van de gemeenschappelijke sequentievarianten te identificeren op de fenotypische variabiliteit van veel voorkomende ziekte 4,5. Al met al hebben deze waarnemingen leidden tot de evolutie van de veel voorkomende ziekte / Rare Variant hypothese suggereert dat de meerderheid van de &quot;ontbrekende erfelijkheid&quot; in gemeenschappelijke en complexe fenotypes in plaats daarvan is het gevolg van persoonlijke van een individu profiel van zeldzame of prive-DNA-varianten 6-8 . Echter, het karakteriseren van hoe zeldzaam variatie complexe fenotypes van invloed vereist de analyse van een groot aantal getroffen personen op vele genomische loci, en is ideaal ten opzichte van een vergelijkbaar onderzoek in een cohort niet aangetast. Ondanks de sequencing stroom die door platforms van vandaag, eende bevolking op basis van onderzoek van een groot aantal genomische loci en de daarop volgende vereist computationele analyse blijft onbetaalbaar voor vele onderzoekers. Om aan deze behoefte aan te pakken, hebben we een gecombineerde aanpak volgorde 1,9 en een nieuw software pakket 1 voor zeer nauwkeurige zeldzame variant detectie van de resulterende gegevens. De mogelijkheid tot het zwembad genomen van de gehele bevolking van de getroffen individuen en onderzoek de mate van genetische variatie op meerdere beoogde regio&#39;s in een enkele volgorde bibliotheek biedt een uitstekende kosten-en tijdsbesparing voor de traditionele single-sample sequencing methode. Met een gemiddelde sequencing dekking per allel van 25-voudig onze aangepaste algoritme, SPLINTER, maakt gebruik van een interne variant bellen controle strategie om inserties, deleties en substituties oproepen tot vier baseparen lang zijn met een hoge gevoeligheid en specificiteit van de zwembaden van maximaal 1 mutant allel in 500 individuen. Hier beschrijven we de werkwijze voor de bereiding van de samengevoegde sequencing bibliotheek gevolgd door een stap-voor-stap instructies over hoe de SPLINTER pakket te gebruiken voor mengmonsters van sequentie-analyse ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). We tonen een vergelijking tussen gepoolde sequencing van 947 individuen, die allemaal onderging ook genome-wide array, op meer dan 20kb van sequencing per persoon. Overeenstemming tussen genotypering van gelabeld en nieuwe varianten genoemd in het verzamelmonster waren uitstekend. Deze methode kan gemakkelijk worden opgeschaald naar een willekeurig aantal genomische loci en een aantal individuen. Door de integratie van de interne positieve en negatieve amplicon de controles aan de ratio&#39;s die de bevolking na te bootsen onder studie, kan het algoritme worden gekalibreerd voor optimale prestaties. Deze strategie kan ook worden aangepast voor gebruik met hybridisatie vangen of individuele specifieke barcodes en kan worden toegepast om de volgorde van nature heterogene monsters, zoals tumor DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Gepoolde DNA-sequencing is een snelle en kosteneffectieve strategie voor zeldzame varianten geassocieerd met complexe fenotypes in grote cohorten op te sporen. Hier beschrijven we de computationele analyse van gecombineerde, next-generation sequencing van 32 kanker-gerelateerde genen met behulp van de SPLINTER softwarepakket. Deze methode is schaalbaar, en van toepassing op alle fenotype van belang.

Detectie van zogenaamde Rare Genomic Varianten uit gepoold Sequencing gebruiken SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...