Name: detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Barnas Discovery Institute stipend MC-II-2006-1 (RDM og TED), NIH epigenetikk Roadmap stipend [1R01DA025744-01 og 3R01DA025744-02S1] (RDM og FLMV), U01AG023746 (SC), den Saigh Foundation (FLMV og TED), 1K08CA140720-01A1 og Alex &#39;Lemonade Stand &quot;A&quot; Award støtte (TED). Vi takker Genome Technology Access Center ved Institutt for genetikk ved Washington University School of Medicine for hjelp med genomisk analyse. Senteret støttes delvis av NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842 til Siteman Cancer Center og ved IKT / CTSA Grant # UL1RR024992 fra NationalCenter for Research Resources (NCRR), en komponent av National Institutes of Health (NIH), og NIH Veikart for Medical Research. Denne publikasjonen er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn NCRR eller NIH.

<ol>
	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Det er økende bevis for at forekomsten og terapeutisk respons av vanlige, komplekse fenotyper og sykdommer som fedme 8, hyperkolesterolemi 4, hypertensjon 7 og andre kan bli moderert av personlige profiler av sjeldne variasjon. Identifisere gener og gangstier hvor disse variantene aggregerte i berørte befolkninger vil ha dyptgripende diagnostiske og terapeutiske implikasjoner, men analysere berørte enkeltpersoner separat kan være tid og koste prohibitive. Befolkning-baserte analyser gir en mer effektiv metode for kartlegging genetisk variasjon på flere loci. Vi presenterer en roman samlet DNA-sekvensering protokollen sammen med Splinter programvarepakken utformet for å identifisere denne typen genetisk variasjon på tvers av befolkningsgrupper. Vi viser nøyaktigheten av denne metoden for å identifisere og kvantifisere mindre alleler innen en stor samlet befolkning på 947 personer, inkludert sjeldne varianter som varringte de novo fra den samlede sekvensering og validert av individuell pyrosequencing. Vår strategi skiller seg hovedsakelig fra andre protokoller ved inkorporering av en positiv og en negativ kontroll i hvert eksperiment. Dette gjør Splinter å oppnå mye høyere nøyaktighet og kraft i forhold til andre tilnærminger 1. Den optimale dekning av 25-fold per allel er fast uavhengig av størrelsen på bassenget, noe som gjør analyse av store bassenger gjennomførbar da dette kravet bare skalerer lineært med basseng størrelsen. Vår tilnærming er svært fleksibel og kan brukes på alle fenotype av interesse, men også til prøver som er naturlig heterogen, for eksempel blandede celle populasjoner og tumor biopsier. Gitt den stadig økende interessen samlet sekvensering fra store målet regioner som exome eller genom, er vårt bibliotek prep og Splinter analyse kompatibel med custom-fangst og hel-exome sekvensering, men justeringen verktøyet i Splinter pakken ble ikke konstruert for storreferanser sekvenser. Derfor har vi lykkes utnyttet dynamisk programmering aligner, Novoalign, for genom-wide alignments etterfulgt av variant ringer fra samleprøve (Ramos et al., Innsendt). Dermed kan vår samles sekvensering strategi skalere hell til større forekomster med økende mengder av målet sekvens.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Navn </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Seksjon </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> Betaine </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vektor </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> T4 Polynucleotide Kinase </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> T4 ligase </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Polyetylenglykol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Bioruptor sonicator </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2.3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Som DNA-sekvensering teknologi har markert avansert i de senere år 2, har det blitt stadig tydeligere at mengden av genetisk variasjon mellom to individer er større enn tidligere antatt tre. I motsetning, har matrise-basert genotyping ikke klarte å identifisere et betydelig bidrag av felles sekvens varianter til den fenotypiske variasjon av vanlig sykdom 4,5. Til sammen har disse observasjonene ført til utviklingen av vanlig sykdom / Sjeldne variant hypotese antyder at flertallet av &quot;the missing arvbarhet&quot; i vanlige og komplekse fenotyper er stedet på grunn av den enkeltes personlige profil av sjeldne eller private DNA-varianter 6-8 . Men å karakterisere hvor sjelden variasjon påvirker komplekse fenotyper krever analyse av mange berørte enkeltpersoner på mange genomisk loci, og er ideelt i forhold til en tilsvarende undersøkelse i en upåvirket kohort. Til tross for sekvensering makten tilbys av dagens plattformer, enpopulasjonsbasert undersøkelse av mange genomisk loci og den påfølgende beregningsanalyse kreves fortsatt uoverkommelige for mange etterforskere. For å møte dette behovet, har vi utviklet en samlet sekvensering tilnærming 1,9 og en roman programvarepakke en for svært nøyaktig sjelden variant oppdagelse fra den resulterende data. Muligheten til å pool genomer fra hele bestander av berørte enkeltpersoner og kartlegge graden av genetisk variasjon på flere målrettede regioner i et enkelt sekvensering bibliotek gir utmerket kostnad og tidsbesparelser for tradisjonelle én-utvalg sekvensering metodikk. Med en gjennomsnittlig sekvensering dekning per allelet av 25-fold, bruker vår skikk algoritme, Splinter, en intern variant ringer kontroll strategi for å kalle innsettinger, slettinger og erstatninger på opptil fire basepar i lengde med høy sensitivitet og spesifisitet fra bassenger på opp til 1 mutant allel i 500 individer. Her kan vi beskrive metoden for å utarbeide den samlede sequencing bibliotek etterfulgt av steg-for-steg instruksjoner om hvordan du bruker Splinter pakke for samlet sekvensering analyse ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Vi viser en sammenligning mellom samlet sekvensering av 947 individer, som alle også gjennomgikk genom-wide array, på over 20KB av sekvensering per person. Samsvar mellom genotyping av merket og nye varianter kalles i samleprøve var utmerket. Denne metoden kan enkelt skaleres opp til en rekke av genomisk loci og en rekke enkeltpersoner. Ved å innlemme de interne positive og negative fragment kontroller på forhold som etterligner befolkningen som studeres, kan algoritmen kalibreres for optimal ytelse. Denne strategien kan også endres for bruk med hybridisering fangst eller individuell-spesifikke strekkoder og kan brukes til sekvensering av naturlig heterogene prøver, for eksempel svulst DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Pooled DNA sekvensering er en rask og kostnadseffektiv strategi for å oppdage sjeldne varianter assosiert med komplekse fenotyper i store kohorter. Her beskriver vi datamaskinell analyse av samlet, neste generasjons sekvensering av 32 kreft-relaterte gener ved hjelp av Splinter programvarepakken. Denne metoden er skalerbar, og gjelder for alle fenotype av interesse.

Påvisning av sjeldne genomisk Varianter fra Pooled Sekvensering Bruke Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv Capture av 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomisk Hybridisering (Array CGH) for deteksjon av Genomiske Kopier nummer Varianter

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolere forsterkes Hsp104 Varianter Bruke gjær Proteinopathy modeller

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

TRAP-rc, Sette ribosom Affinitetsrensing fra Rare celle populasjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Målrettet RNA sekvense analysen å karakter Gene Expression og Genomisk Endringer

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Måling av sammenløpet av iPSC-er ved hjelp av et automatisert bildebehandlingssystem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...