Name: rapid fibroblast removal from high density human embryonic stem cell cultures
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een New Faculty Award II van het California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), en een NIH-gefinancierde National Research Award (F32-HL104924)

1. Voorbereiding van muis embryonale Feeders <ol><li> De MEF&#39;s die in de co-cultuur van hESC &#39;vooraf worden behandeld door bestraling of mitomycine-C om de cellen beletten ondergaan splitsing. </li><li> Twee uur voor MEF zaaien, vacht elke 60 mm plasma behandeld kweekschaal met 2 ml van 0,05% gelatine. </li><li> Ontdooien een flesje behandeld MEF en plaat bij ~ 20.000 cellen / cm 2. </li><li> Laat de cellen een nacht hechten. </li></ol> 2. Co-zaaien hESC &#39;s op MEF <ol><...

<ol>
	<li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts.">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li><li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li><li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells.">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li><li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc/hiPSc.">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .</li></ol>

De methode die in dit manuscript biedt een snelle en minder kostbaar alternatief voor het elimineren van fibroblast feeder-cellen uit menselijke embryonale cel culturen. De succesvolle verwijdering van fibroblasten is afhankelijk van het bestaan ​​van een strak confluente monolaag van deze cellen dat zich ontwikkelt in meer stamcelculturen. Na 7-10 dagen, zal de groeiende hESC kolonies druk op de feeder fibroblasten in buitenwaartse richting, het genereren van een steeds dichter wordende fibroblast monolaag tussen k...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblast Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Celkern Marker </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Human ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Human ESC Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Vroege Differentiatie Marker </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Human ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tabel van specifieke reaheren voor immunokleuring de hESC.

rapid fibroblast removal from high density human embryonic stem cell cultures

Muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gebruikt om menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;) culturen vastgesteld na blastocyst isolatie 1. Deze feeder systeem houdt hESC &#39;s uit die een spontane differentiatie tijdens celexpansie. Echter, deze co-cultuur methode is arbeidsintensief, vereist hoog opgeleid personeel, en de opbrengst lage hESC zuiverheid 4. Vele laboratoria hebben getracht het aantal voedercellen in hESC culturen (dwz waarin matrix beklede schalen of feeder cell types 5-8) te minimaliseren. Deze gemodificeerde kweeksystemen is enige belofte, maar nog niet verdrongen de standaard methode voor het kweken van hESC &#39;s met mitomycine C behandelde muizen embyronic fibroblasten om ongewenste spontane differentiatie van de hESC culturen vertragen. Daarom moet de voedingscellen in hESC expansie worden verwijderd tijdens differentiatie experimenten. Hoewel verschillende technieken beschikbaar voor het zuiveren van hESC colonies (FACS, MACS, of het gebruik van resistente vectoren) van feeders, deze technieken zijn arbeidsintensief, duur en / of destructief voor de hESC. Het doel van dit project was om een ​​methode van zuivering dat de oogst van een zuiverder bevolking van hESC &#39;s maakt uitvinden. We hebben gezien dat in een confluente hESC cultuur, de MEF bevolking kan worden verwijderd met behulp van een eenvoudige en snelle aspiratie van de MEF vel. Deze verwijdering is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder laterale cell-to-cell binding van MEFs dat een lagere bindingsaffiniteit voor de styreen kweekschaal hebben en het vermogen van de stamcellen koloniën fibroblasten buiten drukken tijdens de generatie van hun eigen &quot; niche &quot;. De hESC werden daarna onderzocht SSEA-4, Oct3 / 4 en Tra 1-81 tot expressie 10 dagen na verwijdering MEF onderhoud van pluripotentie waarborgen. Bovendien hESC kolonies in staat waren om te blijven groeien uit tot grotere formaties na MEF verwijdering, het verstrekken van een extra niveau van hESC expansie.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures at JoVE.com

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Research

JoVE Journal

Biology

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Muis Epidermale neurale lijst Stem Cell (EPI-NCSC) culturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Voorbereiding van de gepoolde humane bloedplaatjes Lysate (pHPL) als een efficiënte Supplement voor Animal Serum-Free menselijke stamcellen culturen

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...