Name: rapid fibroblast removal from high density human embryonic stem cell cultures
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures at JoVE.com

この作品は、再生医療（RN2-00921から1）、およびNIHの資金国立研究賞（F32-HL104924）カリフォルニア工科大学から新しい教員賞IIによって賄われていた

1。マウス胚性フィーダーの準備<ol><li>ヒトES細胞の共培養に使用されるMEFには、以前に分裂を受けてから細胞を阻害するための放射線照射またはマイトマイシン-Cで扱われるべきである。 </li><li> MEFの播種前に二時間、コートは各60mmのプラズマは、0.05％ゼラチン2mlの培養皿を治療した。 </li><li> 〜20,000細胞/ cm 2で治療を受けたMEFとプレートのバイアルを解凍します。 </li><li>?...

<ol>
	<li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts.">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li><li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li><li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells.">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li><li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc/hiPSc.">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .</li></ol>

本稿で提示した方法は、ヒト胚性細胞培養物から線維芽細胞フィーダー細胞を除去するための迅速かつ安価な代替手段を提供しています線維芽細胞の除去に成功し、より長い幹細胞培養に発症、これらの細胞のコンフルエントな単層しっかりの存在に依存しています。 7-10日後に、成長のhESCコロニーはコロニー間のますます密線維芽細胞単層を生成し、外方向にフィーダー線維芽細胞をプッ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> DDR2メモリ</td><td>サンタクルス</td><td> 7555 </td><td>線維芽細胞マーカー</td></tr><tr><td> DAPI </td><td>カルビオケム</td><td> 268298 </td><td>細胞核マーカー</td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td>ミリポア</td><td> MAB4304 </td><td>ヒトESCマーカー</td></tr><tr><td> Oct 3月4日</td><td>サンタクルス</td><td> 9081 </td><td>ヒトESCマーカー</td></tr><tr><td> Flk-1の</td><td> BDファーマ</td><td> 555307 </td><td>初期の分化マーカー</td></tr><tr><td> TRA-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td>ヒトESCマーカー</td></tr></tbody></table> 表1特定の理由が表紳士はhESCの免疫染色に使用されます。

rapid fibroblast removal from high density human embryonic stem cell cultures

マウス胚線維芽細胞（MEF）は胚盤胞の分離1の後に、ヒト胚性幹細胞（hESC）文化を確立するために使用されていました。このフィーダシステムは、細胞膨張時に自発的分化を受けてからのヒトES細胞を維持しています。しかし、この共培養法は、労働集約的で高度に訓練された人材を必要とし、利回りが低いのhESC純度4。多くの研究室では、hESCの培養におけるフィーダー細胞の数（ すなわち、マトリックスコートディッシュや他のフィーダー細胞タイプ5-8を組み込む）を最小化しようとしました。これらの改変された培養系では、いくつかの約束を示しているが、hESCの文化の不要な自発的分化を遅らせるために、マイトマイシンC処理したマウスembyronic線維芽細胞とヒトES細胞を培養するための標準的な方法を取って代わられていない。したがって、hESCの拡張に使用されるフ​​ィーダー細胞は、分化実験中に除去されるべきである。いくつかの手法がhESCのCOを浄化するために利用可能であるがフィーダからlonies（FACS、MACS、または薬剤耐性ベクターの使用）は、これらの技術は、集中的な高価な、そして/またはhESCのに破壊的労働である。このプロジェクトの目的は、ヒトES細胞の純粋な人口の収穫を可能に精製する方法を考案しました。我々は、コンフルエントhESCの文化では、MEFの人口はMEFのシートの簡便かつ迅速な吸引を用いて除去することができることを観察した。この除去は、 &quot;横細胞から細胞へのスチレン培養皿に低い結合親和性を持っているMEFの結合し、独自の生成中に線維芽細胞が外側にプッシュする幹細胞コロニーの能力など、いくつかの要因に依存していますニッチ &quot;。 hESCの多能性は、その後の維持を確保するため、MEFを除去した後の10日に、SSEA-4、Oct3 / 4の発現およびTRA 1から81までを調べた。また、hESCのコロニーはhESCの拡張の追加レベルを提供し、MEFを除去した後に大規模な地層中への成長を続けることができました。

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Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

遷移文化にフィーダーフリー条件への継続的な努力にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESCの）の導出と文化がマウス胚性フィーダー細胞（MEF）と共培養に大きく依存して残っている。ここでは、急速に、実験開始までにhESCの文化からフィーダを除去するための新規な方法を示しています。

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

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