Name: rapid fibroblast removal from high density human embryonic stem cell cultures
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av en ny fakultet Award II från California Institute of regenerativ medicin (RN2-00.921-1), och en NIH-finansierad Forsknings Award (F32-HL104924)

1. Beredning av Mouse Embryonala matare <ol><li> Den MEF används i samodling av hESCs bör tidigare behandlats genom bestrålning eller mitomycin-C för att inhibera att cellerna från att genomgå delning. </li><li> Två timmar före MEF sådd, päls var 60 mm plasmabehandlas kultur skålen med 2 ml 0,05% gelatin. </li><li> Tina en flaska behandlad MEF och plattan vid ~ 20.000 celler / cm 2. </li><li> Tillåta cellerna att vidhäfta över natten. </li></ol> 2. Co-sådd hESCs PÅ MEF ...

<ol>
	<li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts.">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li><li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li><li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells.">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li><li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc/hiPSc.">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .</li></ol>

Metoden som presenteras i detta manuskript erbjuder en snabb och mindre kostsamt alternativ till att eliminera celler fibroblast feeder från humana embryonala cellkulturer. Den framgångsrika avlägsnandet av fibroblaster är beroende av förekomsten av ett tätt sammanflytande monoskikt av dessa celler som utvecklas i längre stamcellskulturer. Efter 7-10 dagar, kommer de växande hESC kolonierna skjuta feeder fibroblaster i riktning utåt, vilket ger en allt tätare fibroblast monolager mellan kolonier. De starka cel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblast Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268.298 </td><td> Cellkärna Markör </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Humant ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Humant ESC Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555.307 </td><td> Tidig differentieringsmarkör </td></tr><tr><td> TRA-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Humant ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Tabell över specifika reaGents för immunfärgning av hESC.

rapid fibroblast removal from high density human embryonic stem cell cultures

Mus embryonala fibroblaster (MEF) användes för att fastställa mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kulturer efter blastocyst isolering 1. Denna feeder systemet upprätthåller hESCs från att genomgå spontan differentiering under cellens expansion. Emellertid är detta samarbete odlingsmetod arbetsintensiv, kräver välutbildad personal, och ger låg hESC renhet 4. Många laboratorier har försökt minimera antalet matarceller i hESC kulturer (dvs. innefattande matris-belagda skålar eller andra feeder celltyper 5-8). Dessa modifierade odlingssystem har visat några löften, men har inte ersatt standardmetoden för odling hESCs med mitomycin C-behandlade fibroblaster mus embyronic i syfte att fördröja oönskad spontan differentiering av hESC kulturer. Därför bör feeder celler som används i hESC expansionen avlägsnas under differentiering experiment. Även om flera tekniker finns tillgängliga för att rena hESC colonies (FACS, Mac eller användning av läkemedelsresistenta vektorer) från matare, dessa tekniker är arbetsintensiva, kostsamma och / eller destruktiv för hESC. Syftet med detta projekt var att uppfinna en metod för rening som möjliggör skörden av en renare population av hESCs. Vi har observerat att i en sammanhängande hESC kultur kan MEF befolkningen tas bort med hjälp av en enkel och snabb aspiration av MEF arket. Detta avlägsnande är beroende av flera faktorer, inklusive laterala cell-till-cell-bindning av MEF som har en lägre bindningsaffinitet till styren odlingsskålen, och förmågan hos kolonierna stamceller att driva fibroblasterna utåt under alstringen av sin egen &quot; nisch &quot;. Den hESC undersöktes sedan för SSEA-4, Oct3 / 4 och Tra 1-81 uttryck upp till 10 dagar efter MEF bort för att säkerställa upprätthållandet av pluripotens. Dessutom var hESC kolonier kunna fortsätta växa från i större formationer efter MEF bort, vilket ger ytterligare en nivå av hESC expansion.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures at JoVE.com

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Trots pågående insatser övergångsregler kulturer till feeder-fria förhållanden, härledning och kultur av mänskliga embryonala stamceller (hESC) i stort sett är beroende av co-kulturer med mus embryonala matare (MEF). Här visar vi en ny metod för att snabbt avlägsna matare från hESC kulturer före experiment.

Snabb Fibroblast Borttagning med hög densitet mänskliga embryonala stamcellskulturer

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Research

JoVE Journal

Biology

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Passaging nyanser mänskliga embryonala stamceller-linjer med Trypsin

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Mus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) kulturer

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Beredning av poolade humana trombocyter lysat (pHPL) som en effektiv Tillägg för Animal serumfritt mänskliga kulturer Stem Cell

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Ödet Kartläggning av mänskliga embryonala stamcellslinjer som Teratom Bildning

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...