Name: isolation of immune cells from primary tumors
Uploaded: 2012-06-16T14:00:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Immune Cells from Primary Tumors at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Скотт Дарем на рассмотрение рукописи и видео. Работа выполнена при поддержке в части по очной программе исследования NIH, NCI.

<ol>
	<li>Shurin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+cytokines/chemokines/growth+factors+and+tumor+infiltrating+dendritic+cells:+friends+or+enemies.">Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor infiltrating dendritic cells: friends or enemies.</a> Cancer Metastasis Rev. 25, 333-356 (2006).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Res. 66, 605-612 (2006).</li><li>Anderson, M. J., Shafer-Weaver, K., Greenberg, N. M., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerization+of+tumor-specific+T+cells+despite+efficient+initial+priming+in+a+primary+murine+model+of+prostate+cancer.">Tolerization of tumor-specific T cells despite efficient initial priming in a primary murine model of prostate cancer.</a> J. Immunol. 178, 1268-1276 (2007).</li><li>Ganss, R., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+can+restrict+the+effectiveness+of+activated+antitumor+lymphocytes.">Tumor microenvironment can restrict the effectiveness of activated antitumor lymphocytes.</a> Cancer Res. 58, 4673-4681 (1998).</li><li>Shafer-Weaver, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+murine+prostatic+tumors:+continuous+provision+of+T-cell+help+prevents+CD8+T-cell+tolerance+and+activates+tumor-infiltrating+dendritic+cells.">Immunity to murine prostatic tumors: continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells.</a> Cancer Research. 69, 6256-6264 (2009).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Riboldi, E., Shafer-Weaver, K. A., Stagliano, K. E. R., Sklavos, M. M., Ambs, S., Yagita, H., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3a+programs+tumor+associated+dendritic+cells+to+become+tolerogenic+in+Human+and+Murine+Prostate+Cancer.">Foxo3a programs tumor associated dendritic cells to become tolerogenic in Human and Murine Prostate Cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, (2011).</li><li>Shafer-Weaver, K. A., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Specific+CD8++T+Cells+Infiltrating+Prostatic+Tumors+are+Induced+to+Become+Suppressor+Cells.">Tumor-Specific CD8+ T Cells Infiltrating Prostatic Tumors are Induced to Become Suppressor Cells.</a> , (2009).</li><li>Singh, V., Ji, Q., Feigenbaum, L., Leighty, R. M., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+progression+despite+infiltration+by+in+vivo-primed+TRP-2-specific+T+cells.">Melanoma progression despite infiltration by in vivo-primed TRP-2-specific T cells.</a> J. Immunother. 32, 129-139 (2009).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Hurwitz, A. A., Foster, B. A., Allison, J. P., Greenberg, N. M., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRAMP+mouse+as+a+model+for+prostate+cancer.">The TRAMP mouse as a model for prostate cancer.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 20, (2001).</li></ol>

Авторы не имеют соответствующего раскрытия информации.

Этот протокол может быть изменена, в зависимости от размера и источника опухоли (подкожно, спонтанные опухоли, или ортотопической опухоли). Для более крупных опухолей, рекомендуется увеличить размер буфера диссоциации, MAC-буфер, и число стирок. Сердечность клеток, выделенных может зависеть от TME, из которых они обогащаются. Например, в нашем опыте, клеток, выделенных из спонтанных опухолей предстательной железы требует мягкого, чем диссоциация клеток, выделенных из подкожных опухолей меланомы В16. Во время вскрытия опухоли, ликвидировать как много жировой, кожей или другим мусором, что может помешать эффективной ферментативной диссоциации. Очень важно, чтобы полностью переварить опухолевые массы и получения суспензии отдельных клеток, для обеспечения надлежащей маркировки Ab и предотвратить колонны от засорения. Для миелоидной изоляторе, количества фетальной телячьей сыворотки рекомендуется в буфер изоляции ПДК был увеличен с 2% до 10% для улучшения жизнеспособности клеток. Кроме того, эссеntial сохранить все буферы и клеток холодной всей протокол для предотвращения неспецифического связывания Ab и засорение колонки. В заключение, для получения обогащенного популяции антиген представляющих клеток и опухолевый антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, мы изменили и оптимизированы на основе антител изоляции процедура использования технологии Miltenyi Biotech. Используя этот протокол, как восприимчиво передается и эндогенных лейкоцитов населения может быть обогащена использованием Abs направлена ​​против клетки определенного типа поверхностных маркеров. Одним из преимуществ описанной процедуры является уменьшение опухоли мусора переноса после продолжительных и строгих стирки. Это включает использование коллагеназы в промывочный буфер, а также определение точки, в которой дополнительное давление на столбец можно исключить колонку сабо на опухолевые клетки. Получение достаточного количества иммунных клеток из тканей, особенно в чистоте, которая подходит для функционального анализа, может быть трудной задачей.Однако, по нашему опыту, протокол здесь дает самое большое число клеток, в наибольшей чистоте, с самой последовательности.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Реагенты</strong</td&gt;<td<strong&gt; О компании</strong</td&gt;<td<strong&gt; Количество Catalouge</strong</td&gt;<td<strong&gt; Комментарии</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Я коллагеназы</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 17100-017</td&gt;<td&gt; Использовать при выборе для Т-клеток</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Коллагеназы IV</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 17104-019</td&gt;<td&gt; Используйте для миелоидной выбор</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ДНКазы</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 260913</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RPMI</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 21 870</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Дульбеко PBS</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 17-5158</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Фетальной телячьей сыворотки</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 14-501F</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ПДК буфер</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; 2% FBS для Т-клеток<br /&gt; 10% FBS для клеток миелоидной</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thy1.1 PE</td&gt;<td&gt; Ebioscience</td&gt;<td&gt; 551401</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE микрошарики</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 120-000-294</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Защита от Pan DC микрошарики</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 120-003-183</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Защита от CD11b микрошарики</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 120-000-300</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LC колонка</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 130-042-202</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MS колонка</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 130-042-201</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of immune cells from primary tumors

Опухоли создают уникальную микросреду иммуносупрессивных (опухоль микросреде, TME), в котором лейкоциты привлекаются в опухоли различных хемокинов и 1,2 факторов роста. Однако, как только в TME, эти клетки теряют способность содействовать противоопухолевого иммунитета и начать поддерживать рост опухоли и вниз регулировать противоопухолевых иммунных реакций 3-4. Исследования опухолеассоциированным лейкоцитов в основном фокусировались на клетки, выделенные из опухоли дренаж лимфатических узлов или селезенки из-за неизбежных трудностей в получении достаточного количества клеток и чистоты от первичной опухоли. При определении механизмов активации клеток и торговли через лимфатическую систему в опухоли мышей, несущих важно и может дать представление на кинетику иммунный ответ на рак, по нашему опыту, многие лейкоцитов, в том числе дендритные клетки (ДК), в опухоли слива лимфатические узлы имеют различный фенотип, чем те, которые проникают опухолей 5,6. Кроме того, мы уже показали, что восприимчиво-передаются Т-клетки, выделенные из опухоли лимфатических узлов слива не tolerized и способны реагировать на вторичном стимуляции в пробирке в отличие от Т-клеток изолирован от TME, которые tolerized и неспособной распространения или цитокинов Производство 7,8. Интересно, что мы показали, что изменение микроокружения опухоли, таких как обеспечение клеток CD4 + Т-хелперов через приемные передачи, способствует CD8 + Т-клеток для поддержания провоспалительных эффекторные функции 5. Результаты каждого из упомянутых выше исследований показывают важность измерения клеточных реакций от TME-проникновение иммунных клеток, в отличие от клеток, которые остаются на периферии. Для изучения функции иммунных клеток, которые проникают опухолей с использованием изоляции Miltenyi Biotech системы 9, мы изменили и оптимизировать это антитело изоляции на основе процедуры получения высокой электроннойnriched населения антиген представляющих клеток и опухолевый антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. Протокол включает в себя подробное вскрытие мышей ткани простаты из спонтанных модель опухоли простаты (трансгенных Аденокарцинома предстательной железы мыши-TRAMP) 10 и меланомой подкожно (B16) модели опухоли с последующей очистки различных лейкоцитов населения.

Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Immune Cells from Primary Tumors at JoVE.com

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

В этом докладе мы описываем протокол выделения высокоочищенного популяции лейкоцитов, которые проникают опухолей. Этот протокол адаптирован из Miltenyi Biotech протокол для повышения урожайности и чистота выделения клеток из сложной ткани опухоли.

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Выделение первичных Миофибробласты из мышиных и человеческих ткань толстой кишки

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Многоклеточная альвеолярная модель человека, состоящая из эпителиальных клеток и первичных иммунных клеток для оценки опасности

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca2+ и кальциевого тока L-типа

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Выделение клеток первичного клапана человека для моделирования заболеваний in vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...