Name: isolation of immune cells from primary tumors
Uploaded: 2012-06-16T14:00:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Immune Cells from Primary Tumors at JoVE.com

Yazarlar makale ve video inceleme için Dr Scott Durham teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH, NCI intramural araştırma programı ile kısmen desteklenmektedir.

1. Tramp Prostat Tümörler gelen Miyeloid Hücre İzolasyonu <ol><li> Tüm işlemler bir hayvan inceleme kurulu gözetiminde yapıldı. Tramp farelere kendiliğinden probasin promotör 10 tarafından kontrol edilen bir transgen (SV40) bir sonucu olarak otokton prostat tümörleri geliştirmektir. Herhangi bir erkek fare bu işlem için kullanılabilir. Tramp tümörleri her yaşta hasat edilebilir iken, fareler 20 haftadan daha büyük yaş gelene kadar Tramp prostat tümörleri genellikle küçük kaldığı unutulmamalıdır. CO 2 boğularak fareler Euthanize. Periton boşluğuna açık kesme ve adipoz doku geri çekerek, ürogenital sistem (UGT) çıkarın. Yağ dokusu köpüklü, parlak görünümlü bir dokudur. </li><li> Mesane bulun; bu iki büyük, beyaz seminal veziküller arasında doğrudan yatıyor. Forseps ile mesane üzerine tutun. Tutulması makas adipoz doku kurtulmak ve üretra bulun kapattı. U azaltınmümkün olduğunca pelvis yakın olarak rethra ve vaz deferens sever. Düşürürken, aynı zamanda mesane yukarı çekin. Bu şimdi prostat lobları her birini elde etmek mikro-diseke olabilir tüm UGT yayınlayacak. </li><li> Oda sıcaklığında PBS içinde UGT yerleştirin. UGT görselleştirmek ve herhangi bir aşırı yağ dokusu temizlemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Forseps kullanarak, üretra üzerine tutun ve prostat, ventral lateral ve anterior loblar toplamak. Eğer lobların kalanı toplamak ise PBS doku yerleştirin. </li><li> Seminal veziküller çıkartıp atın. </li><li> Kalan doku 180 ° çevirin. Ampuller bezi ve dorsal prostat loblar toplayın. </li><li> Forseps kullanarak, prostat dokusu dışında tease ve sindirim (ayrılma) tampon içine yerleştirin. </li><li> 1 ml ayrışma tamponu (100 U / ml tip IV kollajenaz ve RPMI +% 10 FBS, 100 ug / ml DNase) içinde yer tümör dokusu. Her tümör mayıs require benzersiz ayrışma koşulları; Tramp prostat tümörleri için, 1 ml kullanmak ve B16 tümörler için, (bkz aşağıda) 5 ml kullanın. Not: Kollajenaz (I-IV) notu izole olarak hücre popülasyonunu bağlıdır; lenfosit verim tip I kullanarak daha yüksek iken, miyeloid hücre izolasyonu, tip IV ile en iyisidir </li><li> 37 içinde yer tüpü 30 dakika süreyle ° C inkübatöründe. </li><li> Kolayca akan tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 1 ml pipet ile yukarı ve aşağı Pipeti. </li><li> Filtre 70 mikron filtre ile süspansiyon ve miyeloid hücre izolasyonu için% 10 FBS ile takviye MACs ayırma tamponu ile 3x yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje hücre süspansiyonu. Daha sonra 10 ml MACs tamponu ile pelet durulayın ve aynı ayarlarla tekrar santrifüj. </li><li> 100 ul MACs tampon içinde hücre pelletini. Daha sonra, 10 8 hücreleri (200 ul kültür yüzey 2.4.G2 hibridoma) başına 1 ug anti-CD16/32 antikoru (Ab) ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: tO eklenecek FCR-γ engelleme antikoru (Ab) miktarı dokuda frekans / sayısı FCR-γ + hücreleri ve hücre süspansiyonu hacmi bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, bu adım optimizasyon gerektirebilir. </li><li> &quot;Pan-DC&quot; 100 ul veya anti-CD11b, anti-CD11c veya anti-PUKÖ-1 istenen hücre popülasyonuna bağlı 10 8 toplam hücre başına mikroküreler. 10 ul ekle Not: gerekli mikroboncuk miktarı dokuda istenen nüfusun hücrelerinin frekans / sayısına bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, bu adım optimizasyon gerektirebilir. </li><li> Yavaşça tüp (Vortex Etmeyin) hafifçe vurarak İyice karıştırın ve ışıktan korumalı 4-8 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. Buz üzerinde inkübe etmeyin. </li><li> MAC tampon 10 ml eklenerek hücrelerin yıkanır. 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje. </li><li> Tamamen Süpernatant kapalı dökün ve MAC tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon. Tümör hücre süspansiyonları LC sütunlar aracılığıyla daha iyi akar. (Diğerseçimler: MS, LS, LD). </li><li> Mıknatıslı ayırıcı taze bir sütun uygulayın. Başbakan seçilen sütun için MACs tamponu uygun bir miktarı ile durulama sütun: LC ve MS sütunlar için 500 ul kullanın. LS veya LD için kolon 1 ml kullanın. Astar sütunu sonra, sütun üstüne hücre süspansiyonu uygulanır. Her 1 x 10 8 hücre için bir sütun kullanın. </li><li> Etiketsiz hücreleri (pass-through) toplayın ve sıvı yıkama 1.5-2.5 ml olmak üzere toplam 500 ul hacmine sahip sütun üç (beş) kez en az yıkayın. Sütuna MACs tampon ekleyerek adım 1 yıkayın gerçekleştirir; bu sütun akan tutmak için önemlidir. En kısa sürede sütun son damla damlar gibi, daha fazla tampon ekleyin. Akışı olmadan sütun bekletin ya da (bu saflık mahvetmesine ve hücre canlılığı önemli kaybına yol açabilir sütun kurutma gibi, hafife alınamaz.) Kuru çalışmasına izin vermeyin. Yıkama 2. adım için (de olarak Kollajenaz + DNaz içeren ayrışma tampon karışımı ile sütun durulayınAdım 1.7) &#39;de tarif edildiği, bu ölü veya ölmekte tümör hücrelerinin yapışkan kalıntıları temizlemek için bir &quot;sert&quot; yıkama adımı olarak hizmet vermektedir. MACs tamponu ile 3. adımı uygulayın yıkayın; aracılığıyla akışı yıkama 3. adım sonra tamamen net görünmüyor ise, MAC tampon (5 yıkama toplam) ile 2 ilave yıkama adımlar için yıkamaya devam ediyor. Büyük subkutan tümörler için (örneğin, B16 melanom), son yıkama adımı sırasında, sütunun üstüne bir eldivenli parmak ucu ile hafif basınç uygulanır; bu hücre popülasyonu saf, temiz bir ekstra enkaz bırakır. Bu adım gibi prostat gibi katı doku tümörleri için gerekli değildir, bunun yerine, en az 5-6 kez toplam yıkama, ekstra yıkama adımları kullanın. </li><li> Manyetik ayırıcı ile sütun çıkarın ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. Sütun üzerine tampon pipetle 2 ml. Sıkıca sütunu ile birlikte piston uygulayarak manyetik etiketli hücreleri toplayın. </li><li> Tarafından hücre sayısını sayar ve seçilen hücre nüfus için saflık onaylamaksitometride akar. DC popülasyonun belirlenmesi için önerilen işaretleri B220 ve CD11b CD45, CD11c, PUKÖ-1 içerir. Önerilen makrofaj belirteçler CD45, CD11b, F4-80 ve Ly6C içerir. </li></ol> 2. Subkutan B16 Melanom Tümörler gelen Adoptively Aktarılan T hücrelerinin izolasyonu Bu protokol, 250 mm 2 veya (tümörün iki eşit parçaya böler çapları ölçülerek tahmin) daha az olan tümörler en iyi şekilde çalışır. <ol><li> B16 tümör hücreleri C57BL içine deri altından enjekte edilmiştir / 6 fare ve tümör ölçümü 2 günde 8 kaydedildi. 250 mm 2 ölçüm tümörlü farelerin CO 2 boğularak ötenazi edilir. % 70 EtOH ile yıkanır otoklav cerrahi araçlar kullanılarak, küçük (&lt;3 mm) parçalar halinde kesilmiş ve tümör 5 ml ayrışma çözeltisi (RPMI medyumu% 5 FBS, tip I Kollajenaz (200 U / ml) ve Dnaz i (100 ug ile desteklenmiş içinde kuluçkaya 37, 30 dakika ° C için, / ml)) (a 1000 μ kullanılarak Pipetlemel pipet ucu) ve inkübasyon sırasında her 10 dakikada bir karıştırın. Miyeloid hücreleri daha sonra izole edilir ise, FBS ve Kollajenaz% 10 FBS ve sırasıyla tip IV kollajenaz (200 U / ml), tip I ile% 5 ikame. </li><li> Inkübasyondan sonra, 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçmesi ve 10 ml MACs tampon (üreticinin talimatlarına, Miltenyi Biotech göre hazırlanmış) ile iki kez yıkayın. İsteğe bağlı - çok büyük tümörler için (&gt; 300 mm 2), inflamatuar hücreler yoğunluk gradiyenti santrifüj (Percoll veya Ficoll) kullanılarak önceden zenginleştirilmiş olabilir. </li><li> Yıkama süpernatan aspire ve 1 ug anti-CD16/32 antibody/10 8 hücreleri (klon 2.4.G2 kültür yüzey 200 ul) ekleyin ve 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Yıkama olmadan, yavaşça ışıktan korumalı buz üzerinde 30 dakika için tüp ve inkübe hafifçe vurarak iyice karıştırın, 10 8 hücre başına 1 mikrogram anti-Thy1.1 PE antikor ekleyin. </li><li> Ilişkisiz pri kaldırmak için hücreleri yıkayın5 dakika boyunca 400 x g&#39;de 10 ml tampon MAC ve santrifüj ilave edilerek primer antikor. </li><li> Süpernatant aspire ve üretici talimatlarına göre, 10 7 toplam hücre başına 20 ul anti-PE mikro (Miltenyi Biotech) ekleyin. </li><li> Yavaşça tüp (vorteks istemiyorum) hafifçe vurarak İyice karıştırılır ve 4 ° C&#39;de inkübe ışıktan korumalı 15 dakika, için (buz kullanmayın). Dikkat: vorteks boncuklar bütünlüğü azaltabilir. </li><li> 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj MACs tampon ve 10 ml eklenerek hücrelerin yıkanır. </li><li> 500 ul MACs tampon süpernatan ve Pastör pipetiyle hücreleri aspire. Daha büyük boyutta (&gt; 300 mm 2) arasında olan tümörlerde, 1 ml tampon kullanabilir. </li><li> Manyetik alan ayracı koyun bir LC (Büyük Hücreli) sütun. Tümör hücre süspansiyonları bu sütunlar aracılığıyla iyi akar. Sütun asal üzere 500 ul MACs tamponu ile sütun çalkalayın. Çoğu tümörler de LS ve LD sütunlar dolaşmasını, ancak daha fazla sindirim ve mekanik d gerektirecektirtek hücre süspansiyonu uygun seviyeye ulaşmak için isruption. Sütun asal 1 ml MACs tamponu ile sütun yıkanır. </li><li> Sütun üzerine hücre süspansiyonu uygulayın ve (sütun vadede kuru izin vermeden) tamamen dolaşmasını sağlar. Sonraki, 500 ul MACs tamponu ile yıkayın ve 3x yıkama tekrarlayın. Sadece kolon rezervuar boş olduğunda yeni tampon ekleyebilirsiniz, ancak sütun akışı olmadan ayakta izin vermeyin. Bu tıkanması ve azalan saflık neden olacaktır. </li><li> Bu büyük subkutan tümörler için kritik bir adımdır: son yıkama adımından sonra, eldivenli parmak ucu ile, manyetik ayırıcı devam ederken sütunun üst hafifçe basınç uygulayın. Bu, daha saf zenginleştirilmiş nüfus için fazladan enkaz bırakır. Sonraki, 500 ul MACs tamponu ile kolon 1 kez daha yıkayın. </li><li> Ayırıcısından sütun çıkarın ve temiz bir 15 ml konik tüp yerleştirmek, sütun üzerine 2 ml MACs tamponu ekleyin. Manyetik etiketli cel dışarı floşsıkıca sütuna pistonu iterek ls. </li><li> 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje Elüsyonlanan fraksiyonu. Bu aşamada Saflık genellikle% 75-80 arasındadır. &gt;% 90 saflıkta elde etmek için, yeni bir şekilde MS kolonu kullanılarak adım 1,10-1,12 tarif manyetik ayırma işlemi tekrar edin. MS sütun süspansiyon sütun üzerinden daha yavaş çalışacak şekilde daha küçük ve daha kompakt, ancak yüksek numaraları ve ilgi hücre saflık verecektir. </li><li> Daha sonraki denemeler için hücre sayısını sayar ve flow sitometri ile saflık kontrol edin. Bu tür Bu protokolde tarif edilenler gibi adoptively transfer T hücrelerinin izolasyonu için, kimlik tesbiti için alel belirteçler CD45 ve Thy1.1 (transfer hücreleri) ve Thy1.2 (host T hücreleri) içerir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Belirli bir hücre nüfusu (yani makrofajlar, DC, T-hücresi, vb) arasında verim tümör büyüklüğü ve yönetici edildi tedaviler bağlı olarak değişecektirtümör büyümesi sırasında silinmiştir. Işlenmemiş bir 14-16 haftalık Tramp fare A prostat 5-1x10 6 CD11c + / PUKÖ-1% 90-95 saflıkta veya 1x10 6-1.5x10 6 F4/80 az + (DC) hücreleri + / CD11b 8x10 arasında vermelidir + (makrofajlar) doku 300 mg% 80-90 saflıkta olarak Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, yukarıdaki izolasyon protokolü takip. Bu hücrelerin sayısı, her biri biraz tümör-antijen spesifik T hücre adoptif transferi üzerine arttırır. Zayıf saflık (sütununda tümör kalıntı retansiyon yol açabilir ki) sütunu kurutmak için izin veren, genellikle yetersiz yıkama bir sonucu olan, ya da yetersiz Fc reseptör engelleme. Benzer şekilde, B16 tümörler izole edilen toplam hücreleri de doku hasat zamanı ve DC aşı olan veya olmayan T hücreleri (5x10 6 transferi) (1x10 5 transfer) evlatlık transfer tümörün büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Çok az antijen-SPEantijen-darbeli DC aşısı da T hücre transferinden sonra bir gün verilmedikçe cific T hücrelerinin tümör sızmak. Bir DC aşı küçük bir somut, (&lt;50 mm 2) tümörü taşıyan bir fare,% 80-85 bir saflığa sahip yaklaşık 3x10 5 Thy1.1 + T hücreleri, bir verim tatbik edilirse, bir &quot;iyi düşünülebilir &quot;olarak Şekil 2a&#39;da gösterilen hasat. Daha büyük tümörler hasat edilmiştir, ancak, toplam verim ve saflıkta azalacaktır. Makrofajlar (F4/80 + / CD11b +) genellikle B16 tümörlerde toplam hücre daha küçük bir yüzdesi vardır. Şekil 2B, bir tümör, CD11b kullanan bir 250 mm 2 olduğunu gösterir% 90-95 saflıkta yaklaşık 1x10 6 makrofajlar verimleri . B16 tümörlerde DC nüfusun heterojen olduğu Ayrıca, Şekil 2B gösterir. Prostat tümörlerinde, iki subpopülasyonunun aksine: CD11c + / PUKÖ-1 + (plazmasitoid DC) ve CD11c+ / PDCA-1 - (konvansiyonel DC) B16 melanoma tümörler elde edilebilir. Tahminen 2x10 6 PDC ve 4x10 6 CDC% 80-90 saflıkta az 250 mm 2 B16 tümörlerden bekleniyor. İndirgenmiş saflığı genellikle sütunundan tümörler hücreleri temizleme olmayan bir sonucudur. Adım 2.12 kolonunun tabanındaki devam melanoma hücrelerinde küçük yığın kaldırmak için kritik bir adımdır. Bu aşamadan sonra daha iyi bir saflıkta yıkama adımları ve sonuç etkinliğini arttırır. <img src="/files/ftp_upload/3952/3952fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. DC&#39;ler (CD11c + / PUKÖ-1 +) ve makrofajlar (F4/80 + / CD11b +) bir serseri prostat tümörü izole edilmiştir. Nokta plot değerleri ilgi öncesi veya sonrasında saflaştırılması hücrelerin yüzdesi temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/3952/3952fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2,. (A) Adoptively Thy1.1 + / CD8 + T hücreleri transfer ve (B) CD11c + / PUKÖ-1 dahil Myeloid hücreleri + plasmasitoid DC&#39;ler, CD11c + / PUKÖ-1 - konvansiyonel DC&#39;ler ve F4/80 + / CD11b + makrofajlar subkutan izole edildi Thy1.2 + farelerin B16 melanoma tümör. Nokta plot değerleri ilgi öncesi veya sonrasında saflaştırılması hücrelerin yüzdesi temsil eder.

<ol>
	<li>Shurin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+cytokines/chemokines/growth+factors+and+tumor+infiltrating+dendritic+cells:+friends+or+enemies.">Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor infiltrating dendritic cells: friends or enemies.</a> Cancer Metastasis Rev. 25, 333-356 (2006).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Res. 66, 605-612 (2006).</li><li>Anderson, M. J., Shafer-Weaver, K., Greenberg, N. M., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerization+of+tumor-specific+T+cells+despite+efficient+initial+priming+in+a+primary+murine+model+of+prostate+cancer.">Tolerization of tumor-specific T cells despite efficient initial priming in a primary murine model of prostate cancer.</a> J. Immunol. 178, 1268-1276 (2007).</li><li>Ganss, R., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+can+restrict+the+effectiveness+of+activated+antitumor+lymphocytes.">Tumor microenvironment can restrict the effectiveness of activated antitumor lymphocytes.</a> Cancer Res. 58, 4673-4681 (1998).</li><li>Shafer-Weaver, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+murine+prostatic+tumors:+continuous+provision+of+T-cell+help+prevents+CD8+T-cell+tolerance+and+activates+tumor-infiltrating+dendritic+cells.">Immunity to murine prostatic tumors: continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells.</a> Cancer Research. 69, 6256-6264 (2009).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Riboldi, E., Shafer-Weaver, K. A., Stagliano, K. E. R., Sklavos, M. M., Ambs, S., Yagita, H., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxo3a+programs+tumor+associated+dendritic+cells+to+become+tolerogenic+in+Human+and+Murine+Prostate+Cancer.">Foxo3a programs tumor associated dendritic cells to become tolerogenic in Human and Murine Prostate Cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, (2011).</li><li>Shafer-Weaver, K. A., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Specific+CD8++T+Cells+Infiltrating+Prostatic+Tumors+are+Induced+to+Become+Suppressor+Cells.">Tumor-Specific CD8+ T Cells Infiltrating Prostatic Tumors are Induced to Become Suppressor Cells.</a> , (2009).</li><li>Singh, V., Ji, Q., Feigenbaum, L., Leighty, R. M., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+progression+despite+infiltration+by+in+vivo-primed+TRP-2-specific+T+cells.">Melanoma progression despite infiltration by in vivo-primed TRP-2-specific T cells.</a> J. Immunother. 32, 129-139 (2009).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Hurwitz, A. A., Foster, B. A., Allison, J. P., Greenberg, N. M., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRAMP+mouse+as+a+model+for+prostate+cancer.">The TRAMP mouse as a model for prostate cancer.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 20, (2001).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir ilgili açıklamaları var.

Bu protokol, tümör büyüklüğü ve kaynak (subkutan, spontan tümör veya ortotopik tümörleri) dayanan, modifiye edilebilir. Büyük tümörler için, bu ayrılma tamponu, MAC tamponu ve yıkama sayısı miktarını arttırmak için tavsiye edilir. Izole hücrelerin içtenlik onlar zengin ediliyor hangi TME bağlı olabilir. Spontan prostat tümörleri subkutan B16 melanoma tümörler izole edilen hücreler daha nazik bir ayrışma gerektiren gelen Örneğin, deneyim, hücreleri izole. Tümör diseksiyonu sırasında, çok yağ, deri, ya da etkili enzimatik ayrışma önleyebilir diğer artıkları ortadan kaldırmak. Tamamen tümör kitleleri sindirmek ve uygun Ab etiketleme sağlamak ve tıkanmasını önlemek için kolon, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için kritiktir. Miyeloid hücre izolasyonu için, MAC izolasyonu tampon içinde önerilen fetal sığır serumu miktarı hücre canlılığı iyileştirmek için% 2 ila% 10 artmıştır. Ayrıca esse olduğuSpesifik olmayan bağlanma Ab ve sütunun tıkanmasını önlemek için protokol boyunca soğuk tüm tamponlar ve hücreler tutmak için ntial. Sonuç olarak, antijen sunan hücreler ve tümör antijene özel sitotoksik T lenfosit ile zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için, bu modifiye edilmiş ve Miltenyi Biotech teknolojisi kullanılarak bir antikor bazlı izolasyon prosedürü optimize. Bu protokolü kullanarak, hem adoptively transfer ve endojen lökosit hücre tipine özgü yüzey belirteçleri yöneltilen Abs ile zenginleştirilmiş olabilir. Açıklanan prosedürleri bir avantajı tümör enkaz azaltılması kapsamlı ve titiz yıkama sonrası carry-bitti. Bu, yıkama tamponu yanı sıra, tümör hücreleri tarafından sütunu tıkanma ortadan kaldırabilir kolonuna basınç eklenmiş olduğu bir noktasının belirlenmesine kollajenaz kullanımını içerir. Özellikle de fonksiyonel analizi için uygun olan bir saflıkta dokulardan bağışıklık hücreleri, yeterli sayıda elde edilmesi zor bir iştir.Ancak, deneyim, protokolü burada en tutarlılık, büyük saflıkta, hücrelerin en yüksek sayısını verir.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog Numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajenaz I</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 17100-017</td&gt;<tdT hücreleri için seçerken kullan&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajenaz IV</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 17104-019</td&gt;<td&gt; Miyeloid seçimi için kullanın</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNaz</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 260.913</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RPMI</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 21.870</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco PBS</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 17-5158</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fetal Bovine Serum</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 14-501F</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MACs Tampon</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<tdT hücreleri için&gt;% 2 FBS<br /Miyeloid hücreleri için&gt;% 10 FBS</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thy1.1 PE</td&gt;<td&gt; Ebioscience</td&gt;<td&gt; 551.401</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE mikroküreler</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 120-000-294</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Pan DC mikroküreler</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 120-003-183</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-CD11b mikroküreler</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 120-000-300</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LC sütun</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 130-042-202</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MS sütun</td&gt;<td&gt; Miltenyi Biotech</td&gt;<td&gt; 130-042-201</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of immune cells from primary tumors

Lökositlerin çeşitli kemokinler ve büyüme faktörleri 1,2 tümör içine alınırlar sayede tümörlerin benzersiz bir immünsupresif mikro (tümör mikro, TME) oluşturun. Ancak, bir kez TME, bu hücreler anti-tümör bağışıklığını teşvik ve tümör büyümeyi desteklemek ve anti-tümör immün yanıtlar 3-4 aşağı düzenleyen başlamak için yeteneklerini kaybederler. Tümörle ilgili lökositleri Çalışmalar ağırlıklı olarak izole edilen hücreler üzerine odaklanmıştır tümör-boşaltma primer tümörün yeterli hücre sayıları ve saflık elde doğal zorluklar nedeniyle lenf düğümleri veya dalak. Tümörlü farelerin lenf sistemi yoluyla hücre aktivasyonu ve ticareti mekanizmalarının belirlenmesi önemli olduğunu ve kansere karşı immun yanıtların kinetiğine fikir verebilir iken, bizim deneyim, dendritik hücreler (DC) dahil olmak üzere birçok lökosit, tümör-boşaltma lenf düğümleri tümörler 5,6 sızmaya olanların farklı bir fenotipi. Ayrıca, daha önce izole edilen T hücrelerinin adoptively-transfer olduğunu göstermiştir tümör-lenf düğümleri suretiyle tolerans ve Tolerans geliştirilmiş ve proliferasyon veya sitokin aciz TME izole edilen T hücrelerinin aksine, in vitro ikincil uyarım yanıt yeteneğine sahip değildir üretimi 7,8. İlginçtir, bu tür evlatlık transferi ile CD4 + T yardımcı hücreler sağlamak gibi tümör mikro, değişen CD8 teşvik eden + T hücreleri pro-enflamatuar efektör fonksiyonları 5 korumak göstermiştir. Daha önce de belirtildiği çalışmaların sonuçları her birinden periferi kalır hücrelerin tersine TME-sızmakta bağışıklık hücreleri hücresel yanıtları ölçmek önemini göstermektedir. Miltenyi Biotech izolasyon sistemi 9 kullanılarak tümörler sızmaya bağışıklık hücrelerinin işlevini incelemek için, biz çok e edinmek için bu antikor bazlı izolasyon prosedürü değiştirilmiş ve optimizeAntijen sunan hücreler ile tümör antijene özel sitotoksik T lenfosit nriched popülasyonları. Protokol kendiliğinden bir prostat tümör modeli (Transgenik Fare Adenokanser Prostat Tramp) 10 ve cilt altı melanom (B16) çeşitli lökosit sonraki saflaştırma takip tümör modelinden murin prostat dokusunun ayrıntılı bir diseksiyon içerir.

Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Immune Cells from Primary Tumors at JoVE.com

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Bu yazıda, tümör infiltre lökositlerin oldukça saflaştırılmış nüfusu izole edilmesi için bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, karmaşık tümör doku hücreleri izole edilmesi için, verim ve saflıkta geliştirmek için Miltenyi Biotech protokolü uyarlanmıştır.

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

In vitro Hastalık Modellemesi için İnsan Primer Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...