Name: rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis
Uploaded: 2012-05-20T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af bestyrelsen for Regents i staten Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) og Tulane Hypertension og Renal Center of Excellence finansieret af NIH tilskud P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

1. Kirurgisk Procedure Set-Up Notes <ol><li> Forud for operationen sterilisere kirurgiske forsyninger og instrumenter. Leveringer, der anvendes til den sterile kirurgiske procedure for hver rotte indbefatter en afdækningsstykke skal udlægges som en steril overflade til placering af instrumenter, til et afdækningsstykke med en forskåret hul omkring 0,5 cm x 1,5 in midten anbringes over rotte og gaze. Den forskårne hul på filmen på linie med indsnit foretaget på rotten. Nødvendige instrumenter til operation omfatter en standard saks, der skal anvendes til at skære suturmateriale, to pincet og et fint nåleholder til håndtering og gribning af suturen og en skalpel med et blad. Vi har listet de fælles værktøjer, der anvendes af vores laboratorium i tabellen af ​​specifikke kirurgiske materialer og værktøjer. Men den endelige valg af værktøjer afhænger eksperimentator præferencer. </li><li> Forbered kirurgi plads. Placere en 100 ml 0,9% sterilt saltvand pose under en varmepude at sikre, at saltvand, der kommer i kontakt wed mesenterium vævet forvarmes til ca 37 ° C. Som et alternativ til, saltvand, kan man benytte Ringers opløsning eller et andet fysiologisk buffer. Læg steriliserede kirurgiske instrumenter og forsyninger på et sterilt forklæde for let adgang under eksteriorisering procedure. Desuden skal du bruge sterile vatpind applikatorer og de relevante 3 typer suturer (4-0, 5-0 og 7-0). Sørger pakkerne forhånd åbnes, således at materialerne kan tilgås med sterilt håndtering. Endelig desinficere præ-modificerede plastmateriale trin ved nedsænkning i 100% ethanol i mindst 5 minutter. Scenen er en 100 mm petriskål med en elliptisk hul skåret i midten (figur 1). En Dremel værktøj kan anvendes til indledningsvis at foretage og, om nødvendigt, udvides hullet. Efter hullet er fremstillet, er kanterne af snittet plast fremstillet glat under anvendelse sandpapir af forskellige korn. Den fase vaskes derefter, og endelig enten inert modellervoks (indkøbt fra en lokal Crafts butik) eller silicpå lim tilsættes til hullets kant for at tilvejebringe en hævet, glat overflade. Forud for kontakt med vævet, vil fase skal være tilstrækkelig skyllet med sterilt saltvand. </li><li> Til denne model af angiogenese, typisk anvender vi voksne Wistar-hanrotter (350 ± 25 g). Andre rottestammer og alder, kan anvendes. I vores laboratorium, er rotter bedøvet via intramuskulær injektion med ketamin (80 mg / kg legemsvægt), xylazin (8 mg / kg legemsvægt), og atropin (0,08 mg / kg legemsvægt). Efter cirka 5 minutter, er virkningen af ​​anæstesi bekræftet og rottens abdominale hud barberes. </li></ol> 2. Rotte mesenterium eksteriorisering Model <ol><li> Placere bedøvede rotte på ryggen på en varmepude til at opretholde legemstemperatur. Aseptiske teknikker anvendes under den kirurgiske procedure. Brug sterile handsker og tillader ikke instrumenter og udstyr til at kontakte ikke-sterile overflader andre end de rottevæv. </li><li> Rens abdominale område med alternerende klude USIng af gaze gennemvædet med 70% isopropyl og iod. </li><li> Ved hjælp af skalpelblade, at en lille (ca. 0,75 inch) langsgående snit langs huden og derefter linea alba omkring 1 inch under brystbenet. </li><li> Placere forskårne afdækningsstykke i den abdominale del, således at åbningen ligger på linie med indsnit. </li><li> Tryk forsigtigt omkring snittet. Denne regel vil resultere i eksponering af tyndtarmen nok til at den let kan identificeres. </li><li> Brug af vatpind applikatorer, forsigtigt trække en del af tyndtarmen og find ileum. Idet mesenteriet trækkes ud, bør det forsigtigt lagt i plast trin (fig. 2). </li><li> Identificere 6-8 vaskulariserede mesenteriske vinduer. En mesenteriske vindue er defineret som den tynde gennemskinnelige membranen mellem arterie / vene par fodring tyndtarmen (figur 2). </li><li> Optag starttidspunktet for eksteriorisering. Lad mesenteRy sektion blotlagt i 20 minutter. I eksteriorisering periode anvende en steril sprøjte (5 ml) til intermitterende tilføre saltvand i petriskålen for at sikre, at vævet forbliver nedsænket og ikke tørrer ud. </li><li> Under den 20-minutters eksponeringstid, markere de 2 centralt beliggende mesenteriske vinduer med steril 7-0 sutur. Mærkerne skal foretages i fedt nær tarmen. </li><li> Returnerer blotlagt område af mesenteriet til den abdominale kavitet. </li><li> Lukke bugmuskel med 5-0 monofilament sutur i afbrudt mønster. </li><li> Lukke huden med 4-0 monofilament sutur i afbrudt mønster. </li><li> Tør sutureres området med alternerende skubbes ved hjælp af steril gaze gennemvædet med 70% isopropoyl og iod. </li><li> Spredes øje smøremiddel gel på begge øjne rotten. Med henblik på smøring af øjet er at forhindre udtørring af hornhinden under kirurgiske indgreb og genvinding. Anvendelse af øjet smøremiddel skal anvendesforud for starten af ​​kirurgisk indgreb. Hvis det er nødvendigt, ansøge igen eye smøremiddel før du returnerer rotten til sit bur til nyttiggørelse. </li></ol> 3. Tissue Høst og fiksering <ol><li> På dagen af ​​interesse efter stimulering, bedøve og aflive rotten. I vores laboratorium, er rotter bedøvet via intramuskulær injektion med ketamin (80 mg / kg legemsvægt), xylazin (8 mg / kg legemsvægt), og atropin (0,8 mg / kg legemsvægt) og derefter aflives via intrakardial injektion af beuthanasia. Beuthanasia er en pentobarbitalnatrium / phenytoin opløsning, der kan anvendes til hurtig og smertefri eutanasi. Per rotte vores laboratorium typisk tilfører 0,1 til 0,2 ml. </li><li> Re-åbne bughulen, og fjern forsigtigt tyndtarmen og find de to-mærkede vinduer. </li><li> Skær ud hver af de blotlagt mesenteriske vinduer med pincet og mikro-sakse. Herunder en kant af fedt pr vindue er fordelagtig med henblik på senere væv spredning på mikroskopobjektglas. Straks, Fordybe hvert vindue i PBS. Når der skæres, så prøv at undgå at skære igennem arterie / vene par inden fedt kant af vinduerne for at minimere den potentielle blod fyldning af vinduerne. Også minimere skære gennem tarmen, der resulterer i tarmindholdet kontakt vinduerne. </li><li> Brug en pincet til at sprede væv på positivt ladede objektglas. To væv kan monteres pr slide. </li><li> Tillade væv at delvist tørre og under anvendelse af en skalpel fjerne overskydende fedt. </li><li> Væv er nu klar til at blive fast. Typiske fikseringsmetoder kan anvendes. I vort laboratorium, almindeligvis vi rette objektglassene i methanol (-20 ° C) i 30 min. Vellykket mærkning er også blevet udført med ufikserede væv. Fiksering metoder kan afhænge af din foretrukne antistof. </li></ol> 4. Tissue Immunolabeling <ol><li> Væv kan nu generelt mærkes i henhold til instruktioner pr antistof for immunhistokemi. Da vores interesse i at identificere de rolleraf vaskulære pericytes under angiogenese, almindeligvis vores laboratorium etiketter til endotelceller og perivaskulær celler 10, 12, 13. Anvendelige mærker at identificere endotelceller langs hierarki af mikrovaskulære net er en anti-PECAM-antistof eller BSI-lectin. Perivaskulære cellemarkører anvendt i dette væv indbefatter NG2, desmin, SM-α actin, PDFGRβ og klasse III β-tubulin. Nedenfor i afsnit 3,3, har vi opført protokoller for kolorimetriske og fluorescerende PECAM immunolabeling protokoller. </li><li> Før den første primære antistof inkubering objektglassene er vakuumtørret for at fjerne overskydende pufferopløsning. Desuden er væv først beskrevet med en voks pen til at forhindre ukontrolleret strømning af antistofopløsninger væk fra vævet. Endelig er alle mærkning trin efterfulgt af vasketrin. For vasketrin er lysbilleder anbragt inde farvning krukker. Pufferopløsningen udskiftes 3 gange i løbet af vask varighed. </li><li> Endotelceller antistof etikettering: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM Kolorimetrisk Lableing <ol><li> Primært antistof inkubation: Dryp ca 100-200 ml primært antistof-løsning (1:200 musemonoklonalt biotinyleret CD31 antistof fortyndet i antistof buffer (0,1% saponin i PBS + 2% BSA)) oven på hver væv, og sørg for hele vævet er dækket med antistof-opløsning. Inkubation i 1 time ved stuetemperatur. </li><li> Vask væv med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Sekundært antistof inkubation: drop sekundært antistof-opløsning (Vectastain Elite ABC-opløsningen fra Vector Laboratories, en streptavidinperoxidase sekundært antistof opløsning) på toppen af ​​væv. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. </li><li> Vask væv med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Inkuber væv med Vector Nova Red i 15 minutter. Derefter stiger væv med vand. </li><li> Mount dias: Dip dias i 95% ethanol 10 gange. Nedsænkes glider i 100% ethanol i 2 minutter. Nedsænk objektglassene i et andet 100% ethanol, såresolution i 2 minutter. Derefter nedsænkes dias i træk 100% xylenopløsninger i 2 minutter hver. Lad det tørre og dække væv med et tyndt lag af VectaMount og et dækglas. </li></ol> PECAM fluorescensmærkning <ol><li> Primært antistof inkubation: Dryp ca 100-200 ml primært antistof-løsning (1:200 musemonoklonalt biotinyleret CD31 antistof fortyndet i antistof buffer (0,1% saponin i PBS + 2% BSA)) oven på hver væv, og sørg for hele vævet er dækket med antistof-opløsning. Inkubation i 1 time ved stuetemperatur. </li><li> Vask væv med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Sekundært antistof inkubation. Dryp sekundært antistof-opløsning ((1:100 Streptavidin-Cy3 fortyndet i antistofbuffer (0,1% Saponin i PBS + 2% BSA)) på toppen af ​​væv inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. </li><li> Vask væv med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Mount dias: Dryp 50:50 PBS med glycerol på toppen af ​​væv. Dækmed låg slip. Derefter skal du bruge neglelak til at lukke hullet mellem cover slip og slide. </li></ol></li></ol> 5. Repræsentative resultater Repræsentative billeder af rotte mesenterium væv immunohistokemisk mærket til PECAM er vist i figur 3. PECAM mærkning identificerer alle skibstyper langs hierarki remodeling mikrovaskulære netværk og kan bruges til at kvantificere angiogene målinger på specifikke tidspunkter efter stimulering. PECAM mærkning også mulighed for bestemmelse af arterioler versus venuler. Fodring arterioler udviser typisk mindre diametre og langstrakte endotelcelle morfologi sammenlignet med parrede venuler (figur 4). Kapillærer og kapillarspirer kan identificeres baseret på deres kardiameter og relative position i et netværk. Typiske kendetegn ved remodeling net omfatter øget kapillær spiring, kardensitet, vaskulariserede område og venular tortuostet. Kvantificering af forskellige angiogene målinger identificerer tidsforløbet for netværket vækst (figur 5). Kapillar spiring fra allerede eksisterende fartøjer, skygger mellem dag 3 og dag 5 og vender tilbage til det ustimulerede niveau ved Dag 10. Denne forbigående stigning i spiring er efterfulgt af stigninger i vaskulær tæthed og vaskulariserede område. Som bevis for ombygningen af ​​større fartøjer i denne model, også antallet af arteriole og vener segmenter øger over tidsforløb. I vores laboratorium har denne model er blevet anvendt til at identificere cellulære fænotypiske ændringer ved specifikt tidspunkt i løbet af denne omdannelse proces 10, 11. For eksempel angiver klasse III β-tubulin pericytes langs angiogene fartøjer (figur 6). I ustimulerede væv, er klasse III β-tubulin ekspression nerve specifik. I modsætning hertil, under højdepunktet af kapillær spire er klasse III β-tubulin udtrykt af perivaskulære celler. Denne typeaf resultatet fremhæver anvendelse af denne simple og robuste angiogen model til at identificere hidtil ukendte celletyper involveret i den angiogene proces. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Figur 1. Billeder af plast fase præ-og post-modifikation. Præ-modificerede trin er en 100 mm petriskål. Ændringerne omfatter en elliptisk skåret et hul i midten og den efterfølgende tilsætning af modellering ler eller silicium lim til hullets kant for oprettelsen af ​​en hævet, glat overflade. Denne overflade tilvejebringer en indre grænseflade, der letter superfusionssystem af blotlagt mesenteriske vinduer. Målestokken er 1 cm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Figur 2. Billede af blotlagt mesenteriale region. Mesenteriske vinduer defineret som de tynde transparente membranerne mellem arterie / vene par fodring tyndtarmen. Under eksterioriseringvarighed, er det mesenteriale regionen lagt ud, og nedsænkes i saltvand inde i en modificeret petriskål. Inert gul modellervoks tilvejebringer en glat overflade for mesenteriet at blive trukket gennem den forskårne hul. Målestokken er 1 cm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Figur 3. Repræsentative billeder af mesenteriske mikrovaskulære net fra ustimulerede væv og væv fra 3 og 10 dage efter eksteriorisering af mesenteriet. PECAM mærkning identificeret hierarki af mikrovaskulære netværk, herunder, arterioler (A), venuler (V) og kapillærer (C). Indlæg stimulation, mikrovaskulære netværk vises en stigning i kapillær spiring (pilespidser) og kardensitet. Målestokken er 100 um. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Figur 4. Repræsentative billeder af arteriole / venulen par i voksne rotter mesenteriske mikrovaskulær netværksek. I begge billeder kan arterioler (A) kan skelnes fra venuler (V) er baseret på en mindre relativ diameter og langstrakt endotelcelle morfologi. Målestoksforhold er 20 um. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Figur 5 Repræsentative kvantificering af angiogene målinger over tidsforløbet af mikrovaskulære vækst efter mesenteriet eksteriorisering. A) Vaskulær areal pr vævsareal. B) Antal kapillarspirer pr vaskulær område. C) I alt vaskulær længde pr vaskulær område. * Betegner signifikant forskel i forhold til ustimuleret gruppe. Statistiske sammenligninger blev foretaget under anvendelse af en envejs ANOVA efterfulgt af Dunns test. (P &lt;0,05). FN repræsenterer ustimuleret. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Figur 6. Repræsentative fluorescerende billeder af mesenteriske mikrovaskulære netværk fra stimulerede væv og væv i 3 og 10dag sende eksteriorisering af mesenteriet. Immunfluorescent PECAM mærkning (rød) identificerer endotelceller, og klasse III β-tubulin mærkning (grøn) identificerer nerver (pilespidser) og perivaskulære celler (pile). Perivaskulære celler transient opregulere klasse III β-tubulin i kapillær spire. I ustimulerede mikrovaskulære netværk, er klasse III β-tubulin nerve specifikke og ikke identificere perivaskulære celler. 3 dage efter stimulering, klasse III β-tubulin positivt mærker perivaskulære celler sammen mikrokar. På dag 10, begynder klasse III β-tubulin ekspressionsmønster at vende tilbage til ustimulerede scenario. Målestokken er 50 um. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Figur 7. Billeder understøtter gennemførligheden af spore forudmærket lokalt påførte celler under mikrovaskulær netværk vækst stimuleret af mesenteriet eksteriorisering. Cellerne blev overhældt med mesenterIC vinduer i den 20-minutter eksteriorisering periode. 1 dag efter kirurgi, Dil-mærkede celler (rød) blev observeret i dame brændplanet med PECAM positive mikrokar (grøn). A, b) eksempler på Dil-mærkede knoglemarvsceller udviser afrundede og aflang morfologier. I nogle tilfælde (pile)-celler blev forlænget langs mikrokar. C) Eksempel på en klynge af Dil mærkede mesenkymale stamceller nær spidsen af ​​en kapillær spire (pil). Målestoksforhold er 50 um (A) og 20 um (B, C).

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases.">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407, 249-257 (2000).</li><li>le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+hypertension.">Angiogenesis and hypertension.</a> J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).</li><li>Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+remodeling:+a+complex+continuum+spanning+angiogenesis+to+arteriogenesis.">Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis.</a> Microcirculation. 10, 99-111 (2003).</li><li>Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+identification+of+an+extracellular+matrix+scaffold+that+microguides+capillary+sprouting+in+vivo.">Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo.</a> J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).</li><li>Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+stimulus+determines+the+positioning+of+pericytes+within+capillary+sprouts+in+vivo.">Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo.</a> Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).</li><li>Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mast+cell+activation+improves+connective+tissue+repair+in+the+perforated+rat+mesentery.">Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery.</a> Agents Actions. 33, 371-377 (1991).</li><li>Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+sprout+endothelial+cells+exhibit+a+CD36+low+phenotype:+regulation+by+shear+stress+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+mechanism+for+attenuating+anti-proliferative+thrombospondin-1+signaling.">Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling.</a> Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Mesentery+Angiogenesis+Assay.">Rat Mesentery Angiogenesis Assay.</a> J. Vis. Exp. (52), e3078 (2011).</li><li>Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+cells+along+venules+upregulate+NG2+expression+during+microvascular+remodeling.">Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 13, 261-273 (2006).</li><li>Stapor, C. P., Murfee, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+class+III+&#946;-tubulin+as+a+marker+of+angiogenic+perivascular+cells.">Identification of class III &#946;-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells.</a> Microvascular Research. , (2011).</li><li>Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Mesenteric+Microvascular+Networks+from+Spontaneously+Hypertensive+Versus+Normotensive+Rats.">Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats.</a> Microcirculation. , (2011).</li><li>Robichaux, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic/Blood+endothelial+cell+connections+at+the+capillary+level+in+adult+rat+mesentery.">Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).</li><li>Amos, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+The+role+of+human+adipose-derived+stromal+cells+in+inflammatory+microvascular+remodeling+and+evidence+of+a+perivascular+phenotype.">IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype.</a> Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Den eksteriorisering model blev rapporteret i 2006 og er tilpasset fra tidligere mekanisk skade rotte mesenterium modeller for angiogenese 4-7 og frembringer lignende resultater veletablerede IP-injektion modeller, der udnytter rotte mesenteriet 9. Den 20 minutter eksteriorisering tid blev eksperimentelt bestemt til frembringelse af en robust angiogen respons. Mens dette tidsrum kan varieres, men ikke tillader lokal påføring af angiogene inhibitorer 4 for mekanistiske undersøgelser og direkte anvendelse af exogene celler for cellelinie undersøgelser. Gennemførligheden af celle inkorporering i remodellering mesenteriske væv understøttes af indledende forsøg i vores laboratorium med præ-mærkede knoglemarvsceller og mesenchymale stamceller (fig. 7), og ved succes undersøge skæbne af human adipøst afledte stromaceller injektion ip 14 . I vores laboratorium har vi brugt denne model til at identificere pericyte phenotypic ændringer over tidsforløbet af den angiogene respons 10 og vurdere den angiogene potentiale under patologiske tilstande, såsom hypertension 12. Den angiogene respons og cellefænotype ændringer forbundet med denne model også kan observeres i andre rotte mesenteriske angiogene modeller, herunder kronisk hypoxi eksponering 10, 11. En begrænsning af eksteriorisering model er, at de nøjagtige udloesningsmekanismer af angiogenese er ukendte. Eksteriorisering af mesenterium har været forbundet med mastcelledegranulation og øgede histaminindhold 6, men yderligere undersøgelser er påkrævet for at få mere indsigt. Den angiogene stimulus er utvivlsomt multi-faktoriel, der producerer en robust remodeling svar på tværs af hierarkiet i en mikrovaskulær netværk. Mens de ukendte mekanismer fortsat en væsentlig kritik af denne model, dens reproducerbarhed og enkelhed gør det attraktivt for at identificere cellulære dynamik involat the i sagens natur komplekset kapillære spiringsproces. Reproducerbarheden af modellen understøttes af sammenlignelige angiogene metrikker over tidsforløbet af mikrovaskulære net vækst på tværs af flere rottestammer (Wistar og Sprague-Dawley) med tidligere publicerede undersøgelser fra vores laboratorium 10, 12. Idet hovedparten af ​​voksne rotter mesenteriske væv er vaskulariseret, modellen også giver mulighed for flere væv, der skal undersøges for hvert dyr. Desværre er denne model ikke er åbenbart for genetiske musemodeller som mus mesenteriske vinduer har mindre indfødte vaskularisering, og i vores erfaring, ofte mangler observerbare forgrenede netværk. Fremtidige applikationer omfatter undersøgelse af skibet funktionalitet i løbet af angiogenese ved hjælp af intra-vital mikroskopi på bestemte tidspunkter og undersøgelse af relaterede cellulære dynamik involveret i lymphangiogenesis og neurogenese. Selvom omfanget af native vaskularisering pr mesenteriske vindue synes at være rutinemæsghly proportionalt med alderen, har vi observeret forgrening mikrovaskulære netværk i Wistar rotter som unge som 4-5 uger gammel. Disse observationer antyder, at eksteriorisering model også kunne anvendes til at sammenligne de angiogene forskelle i alder.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalognr </td><td> Yderligere kommentarer </td></tr><tr><td> Drapere </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Regelmæssig Sterilisation Wraps </td></tr><tr><td> Noyes Micro Scissor </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro dissekere Spring Saks; Lige og Sharp-Blunt Points, 13mm Cutting Edge, 0.25mm Tip bredde, 4 1/2 &quot;Totallængde </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5135 </td><td> Micro dissekere Tang, Savtakket, let bue, 0.8mm Tip Bredde; 4 &quot;Længde </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5130 </td><td> Micro dissekere Tang, takkede, lige; 0.8mm Tip bredde 4 &quot;Længde </td></tr&gt; <tr><td> 4-0 sutur </td><td> Ethicon </td><td> 699G </td><td> (1,5 metrisk) ETHILON nylonsutur Black Monofilament </td></tr><tr><td> 5-0 sutur </td><td> Ethicon </td><td> 8556 </td><td> (1,0 metrisk) prolene Polyprolene Sy Blå Monofilamenter </td></tr><tr><td> 7-0 sutur </td><td> Ethicon </td><td> 1647G </td><td> (0,5 metrisk) ETHILON nylonsutur Black Monofilament </td></tr><tr><td> Castroviejo Micro nåleholder </td><td> Gode ​​Science Tools </td><td> 12060-02 </td><td> Tip Bredde: 0,6 mm Fastspænding Længde: 5mm Længde: 9cm Lige spids </td></tr><tr><td> Castroviejo nåleholder </td><td> Gode ​​Science Tools </td><td> 12565-14 </td><td> Tip Form: Straight Tip Bredde: 1,5 mm Fastspænding Længde: 10mm Saks: Ingen Lås: Ja Længde: 14cm Savtakket: Ja </td></tr><tr><td> Skalpelhåndtaget </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-9843 </td><td> Skalpelhåndtaget, # 3; faststof; 4 &quot;længde </td></tr><tr><td> Steril kirurgisk kniv </td><td> Cincinnati Kirurgisk </td><td> 0110 </td><td> Rustfrit stål Størrelse 10 </td></tr><tr><td> Petriskål </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Skrå Ridge, Slippable </td></tr></tbody></table> Tabel over specifikke kirurgiske materialer og værktøjer. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalognr </td><td> Yderligere kommentarer </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp Union (Bestilt fra MWI Veterinær Supply) </td><td> MWI #: 011.168 </td><td> Aktiv bestanddel: 100 ml, 390 mg pentobarbital-natrium, 50 mg phenytoinnatrium </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge Animal Health (Bestilt fra MWI Veterinær Supply) </td><td> MWI #: 000.680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> LLOYD. Inc. (Bestilt fra MWI Veterinær Supply) </td><td> MWI #: 009.307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Saline </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Nova Rød </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel af specifikke reagenser

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Microvacular netværk vækst og remodellering er kritiske aspekter af sårheling, inflammation, diabetisk retinopati, tumorvækst og andre sygdomstilstande 1, 2. Netværk vækst er almindeligt tilskrives angiogenese, defineret som væksten af ​​nye fartøjer fra allerede eksisterende fartøjer. Den angiogene proces er også direkte forbundet med arteriogenesis, defineret som kapillar erhvervelse af en perivaskulær celle belægning og skib udvidelsen. Det er overflødigt at sige, angiogenese er kompleks og involverer flere spillere på det cellulære og molekylære niveau 3. Forstå hvordan et mikrovaskulære netværket vokser kræver en identificering af de rumlige og tidslige dynamik langs hierarki af et netværk over tidsforløbet af angiogenese. Denne information er kritisk for udviklingen af ​​terapier rettet mod at manipulere karvækst. Den eksteriorisering model beskrives i denne artikel er en simpel, reproducerbar model til stimulating angiogenese hos rotter mesenteriet. Det blev tilpasset fra sårhelende modeller i rotter mesenteriet 4-7, og er et alternativ til at stimulere angiogenese i mesenteriet via IP injektion af pro-angiogeniske midler 8, 9. Den eksteriorisering model er attraktiv, fordi den kræver minimal kirurgisk indgreb og frembringer dramatiske, reproducerbare stigninger i kapillarspirer, vaskulær areal og vaskulær densitet over en relativt kort tidsforløb i et væv, der tillader den todimensionale visualisering af hele mikrovaskulære net ned til en enkelt celleniveau. Den stimulerede vækst afspejler naturlige angiogene reaktioner i et fysiologisk miljø uden indblanding af udenlandske angiogene molekyler. Anvendelse immunohistokemiske mærkningsmetoder, er denne model vist sig særdeles nyttige til at identificere hidtil ukendte cellulære begivenheder involveret i angiogenese. Undersøgere kan let korrelere de angiogene målinger under tidsforløbet for remodellering med tiden specific dynamik, såsom cellulære fænotypiske ændringer eller cellulære interaktioner 4, 5, 7, 10, 11.

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis at JoVE.com

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Denne artikel beskriver en simpel model for at stimulere angiogenese hos rotter mesenterium. Model frembringer dramatiske stigninger i kapillær spire, vaskulær område og vaskulær densitet over en relativ kort tidsforløb i et væv, der tillader en face visualisering af hele mikrovaskulære net ned til en enkelt celle-niveau.

Rotte mesenterium eksteriorisering: En model til at undersøge de cellulære Dynamics involveret i angiogenese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Research

JoVE Journal

Biology

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

En Eksplantation Assay for vurdering Cellulær Behavior af Cranial mesenkym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Brug af RNA-medieret Interferens fodringsstrategien at screene for gener involveret i Body Size forordning i Nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Én-kanals Cell-attached Patch-clamp optagelse

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammerindretning Teknik at undersøge Regulering af mikrokardannelse permeabilitet i rotte mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En simpel Bioassay for Vurdering af Vascular endotelvækstfaktorer

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...