Name: rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis
Uploaded: 2012-05-20T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av styret i Regents i staten Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) og Tulane Hypertensjon og Renal Center of Excellence finansiert av NIH bevilgning P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

1. Kirurgisk prosedyre Set-Up Merknader <ol><li> Før operasjonen sterilisere kirurgiske forsyninger og instrumenter. Forsyninger som brukes til sterile kirurgiske prosedyren for hver rotte inkludere en drape å bli garderoben ut som en steril overflate for plassering av instrumenter, til en drape med en pre-cut hull ca 0,5 x 1,5 i i sentrum plasseres over rotte , og gasbind. Den pre-cut hull på drape vil justere med innsnitt gjort på rotter. Instrumenter som trengs for kirurgi inkluderer en standard saks som skal brukes til å skjære sutur materiale, to pinsett og en tynn nål holder for håndtering og gripende av sutur, og en skalpell med et blad. Vi har listet opp de vanligste verktøyene som brukes av vårt laboratorium i tabellen over spesifikke kirurgiske materialer og verktøy. Avhenger imidlertid endelig verktøy utvalg på eksperimentator preferanser. </li><li> Klargjør kirurgi plass. Plasser en 100 ml 0,9% sterilt saltvann bag under en oppvarming puten for å sikre at saltvann som kommer i kontakt wed den mesenteriet vevet er forvarmes til ca 37 ° C. Som et alternativ til saltvann, kan du bruke Ringer-løsning eller en annen fysiologisk buffer. Legg ut steriliserte kirurgiske instrumenter og utstyr på en steril drapere for enkel tilgang under exteriorization prosedyren. Dessuten vil du trenge sterile konkave applikatorer og de riktige 3 typer sting (4-0, 5-0, og 7-0). Sørger for at pakkene er ferdig åpnes slik at materialene kan nås med steril håndtering. Til slutt, desinfiser før-modifiserte plast stadium ved å dyppe den i 100% etanol i minst 5 minutter. Scenen er en 100 mm petriskål med en elliptisk hull i midten (figur 1). En Dremel verktøyet kan brukes til utgangspunktet lage og, om nødvendig, utvide hullet. Etter at hullet er gjort, blir kantene av cut plast laget glatt å bruke sand papir av ulike korn. Scenen er så vasket og, til slutt, enten inert modelleire (kjøpt fra en lokal husflid butikk) eller silicpå lim legges til hullet kanten for å gi en hevet, glatt overflate. Før kontakt med vev, vil scenen må være tilstrekkelig skylles med sterilt saltvann. </li><li> For denne modellen av angiogenese, vi bruker vanligvis voksne mannlige Wistar rotter (350 ± 25 g). Andre rotte stammer og aldre kan brukes. I vårt laboratorium, rotter bedøves via intramuskulær injeksjon med ketamin (80 mg / kg kroppsvekt), xylazin (8 mg / kg kroppsvekt), og atropin (0,08 mg / kg kroppsvekt). Etter ca 5 minutter, blir effekten av anestesi bekreftet og rotte abdominal hud er barbert. </li></ol> 2. Rat mesenteriet Exteriorization Model <ol><li> Plasser bedøvet rotte på ryggen på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen. Aseptiske teknikker brukes under den kirurgiske prosedyren. Bruk sterile hansker og ikke tillate instrumenter og utstyr til å kontakte ikke-sterile andre underlag enn rotte vev. </li><li> Rengjør mageområdet med vekslende våtservietter USIng av sterilt gasbind dynket i 70% isopropyl og jod. </li><li> Bruke skalpell blad, lage en liten (ca 0,75 cm) langsgående snitt langs huden, og deretter linea alba ca 1 tomme under brystbenet. </li><li> Plasser pre-cut drapere over abdominal delen slik at åpningen på linje med snittet. </li><li> Press forsiktig rundt såret. Denne regel vil føre til eksponering av tynntarmen nok for den skal være lett identifiseres. </li><li> Bruke konkave applikatorer, trekk forsiktig ut en del av tynntarmen og finn ileum. Som mesenteriet trekkes ut, bør det forsiktig garderoben ut i plast scenen (figur 2). </li><li> Identifiser 6-8 vascularized mesenteriale vinduer. Et mesenteric vindu er definert som den tynne gjennomsiktige membran i mellom Arteria / blodåre parene fôring tynntarmen (figur 2). </li><li> Noter starttidspunkt exteriorization. La mesentery seksjon exteriorized i 20 minutter. Under exteriorization perioden, bruk en steril sprøyte (5 ml) til periodisk fylle saltvann i petriskål for å sikre at vevet fortsatt oppslukt og tørker ikke ut. </li><li> Under 20 minutters eksponeringstid, merker de 2 sentralt beliggende mesenteriale vinduer med sterilt 7-0 sutur. Merkene bør gjøres i fettet område nær tarmen. </li><li> Returner exteriorized regionen av mesenteriet til bukhulen. </li><li> Lukk abdominal muskel med 5-0 monofilament sutur i avbrutt mønster. </li><li> Lukk huden med 4-0 monofilament sutur i avbrutt mønster. </li><li> Tørk sutureres område med vekslende serviettene som bruker sterilt gasbind dyppet i 70% isopropoyl og jod. </li><li> Spre øye smøremiddel gel på begge øynene til rotten. Formålet med å smøre øyet er å hindre uttørking av hornhinnen under kirurgiske inngrep og gjenoppretting. Anvendelsen av øye glidemiddel bør anvendesfør starten av kirurgisk inngrep. Hvis nødvendig, søke på nytt øye glidemiddel før retur rotta til buret sitt for å bli frisk. </li></ol> 3. Tissue Høsting og fiksering <ol><li> På dagen av interesse innlegget stimulering, anesthetize og avlive rotta. I vårt laboratorium, rotter bedøves via intramuskulær injeksjon med ketamin (80 mg / kg kroppsvekt), xylazin (8 mg / kg kroppsvekt), og atropin (0,8 mg / kg kroppsvekt), og deretter avlives via intrakardiell injeksjon av beuthanasia. Beuthanasia er en pentobarbital natrium / fenytoin løsning som kan brukes til rask og smertefri avlivning. Per rotte vårt laboratorium injiserer vanligvis 0,1 til 0,2 ml. </li><li> Gjenåpne bukhulen og fjern forsiktig tynntarmen og finne to-merkede vinduer. </li><li> Klipp ut hver av exteriorized mesenteriale vinduer med tang og mikro-saks. Inkludert en grense fett per vindu er en fordel for senere vev spredning på objektglass. Umiddelbart, Fordype hvert vindu i PBS. Når du kutter, prøv å unngå å skjære gjennom Arteria / blodåre parene innenfor fettet grensen av vinduene for å minimere potensiell blod fylling av vinduene. Også minimere skjære gjennom tarmen som resulterer i intestinal innhold kontakte vinduene. </li><li> Bruk pinsett til å spre vev på positivt ladede objektglass. To vev kan monteres per lysbilde. </li><li> La vev til delvis tørke og bruke en skalpell blad fjerne overflødig fett. </li><li> Vev er nå klar til å fikses. Typiske fiksering metoder kan brukes. I vårt laboratorium, vi vanligvis fikse lysbildene i metanol (-20 ° C) i 30 min. Vellykket merking har også blitt utført med unfixed vev. Fiksering metoder kan avhenge av din foretrukne antistoff. </li></ol> 4. Tissue Immunolabeling <ol><li> Vev kan generelt nå merkes i henhold til instruksjoner per antistoff for immunhistokjemi. Gitt vår interesse i å identifisere rollerav vaskulære pericytes under angiogenese, etiketter vårt laboratorium ofte for endotelceller og perivaskulær celler 10, 12, 13. Nyttige etiketter for å identifisere endotelcellene langs hierarki av mikrovaskulære nettverk er en anti-PECAM antistoff eller BSI-lektin. Perivaskulær celle markører som brukes i dette vevet omfatter NG2, desmin, SM-α actin, PDFGRβ, og klasse III β-tubulin. Nedenfor, i avsnitt 3.3, har vi listet protokoller for kolorimetriske og fluoriserende PECAM immunolabeling protokoller. </li><li> Før den første primære antistoffet inkubasjon, lysbilder er vakuum tørket for å fjerne overflødig buffer løsning. Dessuten er vev i utgangspunktet skissert med en voks penn for å hindre ukontrollert flyt av antistoff løsninger vekk fra vevet. Endelig er alle merking skritt fulgt av vask trinn. For vask trinnene, blir lysbilder plassert inne flekker krukker. Bufferen Løsningen er byttet 3 ganger i løpet av vask varighet. </li><li> Endotelcelle antistoff merking prosedyrer: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM kolorimetrisk Lableing <ol><li> Primær antistoff rugingen: Drypp ca 100-200 ml primær antistoff løsning (1:200 monoklonalt biotinylated CD31 antistoff fortynnes i antistoff buffer (0,1% Saponin i PBS + 2% BSA)) oppå hver vev, sørg hele vev er dekket med antistoff løsning. Inkubering i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Vask vev med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Sekundær antistoff rugingen: Drip sekundært antistoff løsning (VECTASTAIN Elite ABC løsning fra Vector Laboratories, en streptavidin peroksidase sekundært antistoff løsning) på toppen av vev. Inkuber ved romtemperatur i 1 time. </li><li> Vask vev med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Inkuber vev med Vector Nova Red i 15 minutter. Deretter stiger vev med vann. </li><li> Mount lysbilder: dyppglass i 95% etanol 10 ganger. Fordyp glir i 100% etanol i 2 minutter. Fordype lysbilder i en annen 100% etanol såforurensning i 2 minutter. Så fordype lysbilder i påfølgende 100% xylen løsninger for 2 minutter hver. La det tørke og dekke vev med et tynt lag av VectaMount og en dekkglass. </li></ol> PECAM Fluoriserende Merking <ol><li> Primær antistoff rugingen: Drypp ca 100-200 ml primær antistoff løsning (1:200 monoklonalt biotinylated CD31 antistoff fortynnes i antistoff buffer (0,1% Saponin i PBS + 2% BSA)) oppå hver vev, sørg hele vev er dekket med antistoff løsning. Inkubering i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Vask vev med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Sekundær antistoff inkubasjon:. Drip sekundært antistoff løsning ((1:100 streptavidin-CY3 fortynnes i antistoff buffer (0,1% Saponin i PBS + 2% BSA)) på toppen av vev Inkuber ved romtemperatur i 1 time. </li><li> Vask vev med PBS 0,1% saponin i 30 minutter. </li><li> Mount lysbilder: Drypp 50:50 PBS med glyserol på toppen av vev. Dekkmed dekkglass. Deretter bruker neglelakk for å forsegle gapet mellom dekkglass og lysbilde. </li></ol></li></ol> 5. Representative Resultater Representative bilder av rotte mesenteriet vev immunohistochemically merket for PECAM vises i figur 3. PECAM merking identifiserer alle skipstyper langs hierarki av ombygging mikrovaskulære nettverk og kan brukes til å kvantifisere angiogenic beregninger på bestemte tidspunkter innlegget stimulering. PECAM merking gir også for bestemmelse av arterioler versus venules. Fôring arterioler typisk vise større diameter og langstrakt endotelcelle morfologi sammenlignet med sammenkoblede venules (figur 4). Kapillærer og kapillære spirer kan identifiseres basert på deres fartøy diameter og relative posisjon innenfor et nettverk. Typiske kjennetegn ved ombygging nettverk omfatter økt kapillær spirende, fartøy tetthet, vascularized areal og venular tortuosligheten. Kvantifisering av ulike angiogenic beregninger identifiserer tidspunktet løpet av nettverket vekst (figur 5). Kapillær spirende fra pre-eksisterende fartøy, topper mellom dag 3 og dag 5 og returnerer til unstimulated nivå ved Dag 10. Denne forbigående økningen i spirende følges av en økning i vaskulær tetthet og vascularized område. Som bevis for ombygging av større fartøy i denne modellen, øker antallet arteriole og venule segmenter også over tid kurset. I vårt laboratorium, har denne modellen blitt brukt til å identifisere cellulære fenotypiske endringer bestemt tidspunkt i løpet av denne remodeling prosessen 10, 11. For eksempel, identifiserer klasse III β-tubulin pericytes langs angiogenic fartøy (figur 6). I unstimulated vev, er klasse III β-tubulin uttrykk nerve bestemt. I kontrast, i løpet av midten av kapillær spirende, er klasse III β-tubulin uttrykt ved perivaskulær celler. Denne typenav resultat fremhever bruken av denne enkle og robuste angiogenic modell for å identifisere nye celletyper er involvert i angiogenic prosessen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Figur 1. Bilder av plast scenen pre-og post-modifisering. Den før-modifiserte scenen er en 100 mm petriskål. Endringene omfatter en elliptisk hull i midten og den påfølgende tillegg av modelleire eller silikon lim i hullet kanten for opprettelsen av en hevet, glatt overflate. Denne overflaten gir en indre grense som muliggjør superfusion av exteriorized mesenteriale vinduene. Scale bar er 1 cm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Figur 2. Bilde av exteriorized mesenteric regionen. Mesenteriale vinduene er definert som de tynne gjennomsiktige membranene mellom Arteria / blodåre parene fôring tynntarmen. Under exteriorizationvarighet, er det mesenteriske regionen lagt ut og nedsenket i saltvann inne i en modifisert petriskål. Inert gul modellering leire gir en glatt overflate for mesenteriet å bli trukket gjennom pre-cut hull. Scale bar er 1 cm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Figur 3. Representative bilder av mesenteric mikrovaskulære nettverk fra unstimulated vev og vev ved 3 og 10 dager etter exteriorization av mesenteriet. PECAM merking identifiserte hierarkiet av mikrovaskulære nettverk inkludert, arterioler (A), venules (V) og kapillærer (C). Post stimulering, viste mikrovaskulære nettverk en økning i kapillær spirende (pil hoder) og fartøy tetthet. Scale bar er 100 mikrometer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Figur 4. Representative bilder av arteriole / venule parene innenfor voksen rotte mesenteric mikrovaskulær nettverks. I begge bilder, kan arterioler (A) skal skilles fra venules (V) basert på en mindre relativ diameter og langstrakt endotelcelle morfologi. Skala linjene er 20 mikrometer. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Figur 5. Representant kvantifisering av angiogenic beregninger over tid løpet av mikrovaskulær vekst etter mesenteriet exteriorization. A) Vaskulær areal per vev området. B) Antall kapillære spirer per vaskulær område. C) Total vaskulær lengde per vaskulær området. * Representerer vesentlig forskjell i forhold til unstimulated gruppe. Statistiske sammenlikninger ble gjort ved hjelp av en One-Way ANOVA etterfulgt av Dunns test. (P &lt;0,05). FN representerer unstimulated. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Figur 6. Representative fluorescerende bilder av mesenteric mikrovaskulære nettverk fra unstimulated vev og vev ved 3 og 10dager etter exteriorization av mesenteriet. Immunofluorescent PECAM merking (rød) identifiserer endotelceller, og klasse III β-tubulin merking (grønn) identifiserer nervene (pil hoder) og perivaskulær celler (piler). Perivaskulær cellene forbigående upregulate klasse III β-tubulin under kapillær spirende. I unstimulated mikrovaskulære nettverk er klasse III β-tubulin nerve spesifikk og identifiserer ikke perivaskulær celler. 3 dager etter stimulering, klasse III β-tubulin betegner positivt perivaskulær celler langs microvessels. Ved dag 10, begynner klasse III β-tubulin uttrykk mønster å gå tilbake til unstimulated scenario. Scale bar er 50 mikrometer. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Figur 7. Images støtter muligheten for sporing pre-merkede lokalt anvendt celler under mikrovaskulær nettverk vekst stimuleres av mesenteriet exteriorization. Celler ble superfused løpet mesenteric windows under 20 minutters exteriorization periode. 1 dag etter operasjonen, Dii merket celler (rød) ble observert i dame fokalplanet med PECAM positiv microvessels (grønn). A, b) Eksempler på DII merket benmargceller utstilling rundet og langstrakt morfologi. I noen tilfeller (piler) celler ble forlenget langs microvessels. C) Eksempel på en klynge av DII merket stamceller nær spissen av en kapillær spire (pil). Skala linjene er 50 mikrometer (A) og 20 mikrometer (B, C).

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases.">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407, 249-257 (2000).</li><li>le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+hypertension.">Angiogenesis and hypertension.</a> J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).</li><li>Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+remodeling:+a+complex+continuum+spanning+angiogenesis+to+arteriogenesis.">Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis.</a> Microcirculation. 10, 99-111 (2003).</li><li>Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+identification+of+an+extracellular+matrix+scaffold+that+microguides+capillary+sprouting+in+vivo.">Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo.</a> J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).</li><li>Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+stimulus+determines+the+positioning+of+pericytes+within+capillary+sprouts+in+vivo.">Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo.</a> Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).</li><li>Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mast+cell+activation+improves+connective+tissue+repair+in+the+perforated+rat+mesentery.">Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery.</a> Agents Actions. 33, 371-377 (1991).</li><li>Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+sprout+endothelial+cells+exhibit+a+CD36+low+phenotype:+regulation+by+shear+stress+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+mechanism+for+attenuating+anti-proliferative+thrombospondin-1+signaling.">Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling.</a> Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Mesentery+Angiogenesis+Assay.">Rat Mesentery Angiogenesis Assay.</a> J. Vis. Exp. (52), e3078 (2011).</li><li>Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+cells+along+venules+upregulate+NG2+expression+during+microvascular+remodeling.">Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 13, 261-273 (2006).</li><li>Stapor, C. P., Murfee, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+class+III+&#946;-tubulin+as+a+marker+of+angiogenic+perivascular+cells.">Identification of class III &#946;-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells.</a> Microvascular Research. , (2011).</li><li>Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Mesenteric+Microvascular+Networks+from+Spontaneously+Hypertensive+Versus+Normotensive+Rats.">Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats.</a> Microcirculation. , (2011).</li><li>Robichaux, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic/Blood+endothelial+cell+connections+at+the+capillary+level+in+adult+rat+mesentery.">Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).</li><li>Amos, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+The+role+of+human+adipose-derived+stromal+cells+in+inflammatory+microvascular+remodeling+and+evidence+of+a+perivascular+phenotype.">IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype.</a> Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Den exteriorization modellen ble rapportert i 2006 og er tilpasset fra tidligere mekaniske skader rotte mesenteriet modeller av angiogenese 4-7 og produserer lignende resultater til godt etablerte ip injeksjon modeller som tar nytte av rotte mesenteriet 9. Den 20 minutter exteriorization tid ble eksperimentelt bestemt på å produsere en robust angiogenic respons. Mens denne perioden kunne varieres, gjør det mulig for lokal anvendelse av angiogenic hemmere 4 for mekanistiske studier og direkte anvendelse av eksogene celler for celle avstamning studier. Mulighetsstudie av celle innlemmelse i remodeling mesenteric vev er støttet av foreløpige undersøkelser i vårt laboratorium ved hjelp av pre-merkede celler fra beinmargen og stamceller (figur 7), og av suksessen undersøke skjebnen til human adipose-derived stromal celler injeksjon ip 14 . I vårt laboratorium har vi benyttet denne modellen til å identifisere pericyte Phenotypic endringer over tid løpet av angiogenic respons 10 og å vurdere angiogenic potensialet i løpet av patologiske tilstander, for eksempel hypertensjon 12. Den angiogenic respons og celle fenotype endringer knyttet til denne modellen kan også være observert i andre rotter mesenteriale angiogenic modeller, inkludert kronisk hypoksi eksponering 10, 11. En begrensning av exteriorization modellen er at den eksakte utløsende mekanismene for angiogenese er ukjent. Exteriorization av mesenteriet har vært knyttet til mast celle degranulering og økte histamin nivåer 6, men videre undersøkelser er nødvendig for å få mer innsikt. Den angiogenic stimulus er utvilsomt multi-faktoriell, produserer en robust remodeling respons over hierarkiet i en mikrovaskulær nettverk. Mens ukjente mekanismer fortsatt en stor kritikk av denne modellen, dens reproduserbarhet og enkelhet gjør det attraktivt for å identifisere cellulær dynamikk involger i seg selv komplekse kapillær spirende prosess. Reproduserbarheten av modellen er støttet av sammenlignbare angiogenic beregninger over tid løpet av mikrovaskulær nettverk vekst over flere rotter stammer (hann Wistar og kvinne Sprague-Dawley) i tidligere publiserte studier fra vår 10 laboratorium, 12. Siden flertallet av voksne rotter mesenteriale vev er vascularized, gjør modellen også for flere vev som skal undersøkes per dyr. Dessverre er denne modellen ikke åpenbart gjelder genetiske musemodeller som mus mesenteriale vinduene har mindre innfødt vascularization og, i vår erfaring, ofte mangler observerbare, forgreninger nettverk. Fremtidige søknader omfatter undersøkelse av fartøyet funksjonalitet under angiogenese bruker intra-vital mikroskopi på bestemte tidspunkter og etterforskningen av relaterte mobilnettet dynamikk involvert i lymphangiogenesis og neurogenesis. Selv om omfanget av innfødte vascularization per mesenteric vindu synes å være rutinerghly proporsjonal med alder, har vi observert forgrening mikrovaskulære nettverk i mannlige Wistar rotter så unge som 4-5 uker gammel. Disse observasjonene tyder på at exteriorization modellen kan også brukes til å sammenligne de angiogenic forskjeller på tvers av aldersgrupper.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Ytterligere kommentarer </td></tr><tr><td> Drapere </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Regular Sterilisering Wraps </td></tr><tr><td> Noyes Micro Scissor </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Dissecting Spring Saks; Rette og Sharp-Blunt poeng; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tips bredde, 4 1/2 &quot;Overall Lengde </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-5135 </td><td> Micro Dissecting tang, Serrated, svak bue, 0,8 Tips Width, 4 &quot;Lengde </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-5130 </td><td> Micro dissekere tang; Taggete, rette; 0,8 Tips bredde; 4 &quot;Lengde </td></tr&gt; <tr><td> 4-0 sutur </td><td> Ethicon </td><td> 699G </td><td> (1,5 metrisk) ETHILON Nylon Sutur Svart Monofilament </td></tr><tr><td> 5-0 sutur </td><td> Ethicon </td><td> 8556 </td><td> (1,0 metrisk) PROLENE Polyprolene Sutur Blå Monofilament </td></tr><tr><td> 7-0 sutur </td><td> Ethicon </td><td> 1647G </td><td> (0,5 metrisk) ETHILON Nylon Sutur Svart Monofilament </td></tr><tr><td> Castroviejo Micro Needle Holder </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 12060-02 </td><td> Tips Bredde: 0.6mm Klamring Lengde: 5mm Lengde: 9cm Rett tips </td></tr><tr><td> Castroviejo Needle Holder </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 12565-14 </td><td> Tips Shape: Rett Tips Bredde: 1,5 mm Klamring Lengde: 10mm Saks: Ingen Lås: Ja Lengde: 14cm Taggete: Ja </td></tr><tr><td> Skalpell Håndtak </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-9843 </td><td> Skalpell Håndtak, # 3; Solid, 4 &quot;Lengde </td></tr><tr><td> Sterile Surgical Blade </td><td> Cincinnati Kirurgisk </td><td> 0110 </td><td> Rustfritt stål; størrelse 10 </td></tr><tr><td> Petriskål </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Avskårne Ridge, Slippable </td></tr></tbody></table> Tabell over spesifikke kirurgiske materialer og verktøy. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Ytterligere kommentarer </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp Union (bestilles fra MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 011168 </td><td> Virkestoff: Per 100ml, 390 mg pentobarbital natrium, 50mg fenytoinnatrium </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge Animal Health (bestilles fra MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 000680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> LLOYD. Inc. (Bestilt fra MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 009307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Saline </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-CY3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASTAIN Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Nova Rød </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell over spesifikke reagenser

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Microvacular nettverk vekst og ombygging er kritiske aspekter ved sårtilheling, betennelser, diabetisk retinopati, tumorvekst og andre sykdomstilstander 1, 2. Network vekst er ofte knyttet til angiogenese, definert som veksten av nye skip fra pre-eksisterende fartøy. Den angiogenic Prosessen er også direkte knyttet til arteriogenesis, definert som kapillær oppkjøpet av en perivaskulær celle belegg og fartøy utvidelse. Unødvendig å si, er angiogenese kompleks og involverer flere aktører på cellulært og molekylært nivå 3. Forstå hvordan en mikrovaskulær nettverk vokser krever identifisere de romlige og tidsmessige dynamikken langs hierarkiet av et nettverk over tid løpet av angiogenese. Denne informasjonen er avgjørende for utvikling av behandlingsformer som tar sikte på å manipulere fartøy vekst. Den exteriorization Modellen er beskrevet i denne artikkelen representerer en enkel, reproduserbar modell for stimulerelating angiogenese i rotte mesenteriet. Den ble tilpasset fra sårhelende modeller i rotte mesenteriet 4-7, og er et alternativ å stimulere angiogenese i mesenteriet via ip injeksjoner av pro-angiogenic agenter 8, 9. Den exteriorization Modellen er attraktiv fordi det krever minimalt kirurgisk inngrep og gir dramatiske, reproduserbare øker i kapillære rosenkål, vaskulær areal og vaskulær tetthet over et relativt kort tid kurs i en vev som gjør det mulig for de to-dimensjonale visualisering av hele mikrovaskulære nett ned til single celle nivå. Den stimulerte veksten reflekterer naturlige angiogenic responser i en fysiologisk miljø uten innblanding av utenlandske angiogenic molekyler. Bruke immunhistokjemiske merking metoder, har denne modellen vist seg svært nyttig for å identifisere nye mobilnettet hendelser involvert i angiogenese. Etterforskerne kan lett relatere de angiogenic beregningene i den tiden løpet av ombygging med tiden specific dynamikk, som for eksempel mobilnettet fenotypiske endringer eller cellulære interaksjoner 4, 5, 7, 10, 11.

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis at JoVE.com

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Denne artikkelen beskriver en enkel modell for å stimulere angiogenese i rotte mesenteriet. Modellen gir dramatiske økninger i kapillært spirende, vaskulær areal og vaskulær tetthet over en relativt kort tid kurs i en vev som gjør at en face visualisering av hele mikrovaskulære nettverk ned til én celle nivå.

Rat mesenteriet Exteriorization: En modell for å undersøke de cellulære dynamikken i Angiogenese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Research

JoVE Journal

Biology

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

En Eksplantasjon Assay for å vurdere Cellular Behavior av Cranial mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Bruke RNA-mediert interferens fôringsstrategi til skjerm for gener involvert i Body Size forordning i nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Technique å etterforske Regulering av microvessel Permeabilitet i Rat mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En enkel Bioassay for Evaluering av vaskulær endotelial vekstfaktorer

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...