Name: examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Der blev leveret af Becton Dickinson Technologies. Synspunkterne i denne underkastelse er dem af forfatterne og ikke foregiver at afspejle officielle politik den amerikanske regering. Forskningen blev udført i overensstemmelse med dyreværnsloven og andre føderale love og regler vedrørende dyr og eksperimenter, der involverer dyr og tiltræder principperne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, National Research Council, 1996. Den facilitet, hvor denne forskning er udført er fuldt akkrediteret af Association for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International.

1. NALT Indsamling og Dyrkning <ol><li> Aflive mus under anvendelse af godkendte IACUC vejledning. Undgå brug af inhalant bedøvelsesmidler, der kan påvirke NALT. Overfør mus til en aseptisk arbejdsplads eller biosikkerhed kabinet. Fjern den nederste kæbe af musen, og rengør den øverste ganen område med alkohol og jod klude. </li><li> Anvende en nr. 11 kirurgisk blad i kirurgisk kniv håndtaget omhyggeligt skære og udskære øvre gane ved at følge den indvendige kontur af muse fortænder og kindtænder. </li><li> Forsigtigt skræl tilbage ganen med en pincet, og pas på ikke at rive ganen. </li><li> Dette trin er nødvendigt at reducere forureningen af ​​kulturer og er designet til behandling af flere ganer. Sted ganer i individuelle brønde i den første kolonne i en steril 48 brønds-plade på forhånd fyldt med 250 pi af komplet dyrkningsmedium (37 ° C) bestående af RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 ug / ml streptomycin, 100 UI / ml penicillin, 50 ug / ml gentamicinog 1 ug / ml fungizon / amphotericin. Medier bør carbonat pufres ganer dyrkes i en 5% CO2 / 95% fugtig luft-inkubator (37 ° C), eller alternativt anvende 10 mM HEPES pH 7,4, til ikke-CO 2 kultur. </li><li> At vaske ganer, skal du bruge pincet til at flytte ganer i hver efterfølgende godt i træk, forsigtigt trykke pladen mellem hver vask, indtil ganen har gennemgået en total på otte vaske. </li><li> Overføre ganer til en ny steril 48-brønds plade indeholdende 250 pi frisk komplet dyrkningsmedium (37 ° C) i brønde. </li><li> Placere pladerne indeholdende ganer til en 37 ° C inkubator i dyrkning under hele undersøgelsen. </li><li> Indsamle prøver til analyse ved aseptisk overføre 100 pi medium fra dyrkningsbrønde i Eppendorf-rør for hver 24 timer, erstatning med 100 pi frisk 37 ° C dyrkningsmedium. </li><li> Centrifugeres kulturmediet prøverne ved 380 xg i 10 minutter, 4 ° C til pellet debris. </li><li> Supernatanten overføres fra den centrifugerede prøve til friske Eppendorf-rør og opbevares ved -20 ° C indtil klar til analyse. </li><li> Antigenspecifikt IgG, IgM og IgA, eller secernerede cytokiner måles i cellekultur-supernatanter ved standardmetoder enzymkoblede immunosorbentassays (ELISA). </li></ol> 2. Kirurgisk Fjernelse af NALT <ol><li> BALB / c-mus, 7 til 9 uger gamle, er egnede emner, men andre stammer er også acceptable. Tilvejebringe gellignende vådfoder tre dage før kirurgi for at akklimatisere mus til foder og vand erstatning, der vil blive administreret efter operationen. </li><li> Administrere en dråbe Metacam smertestillende medicin (1,5 mg / ml eller 0,05 mg / dråbe) i mundhulen før kirurgi. </li><li> Bedøve mus under anvendelse af godkendte IACUC vejledning, for eksempel med en ketamin, acepromazin, og xylazin-blanding (KAX) og anvende Puralube Vet salve på øjnene for at forhindre udtørring. Undgå brug af inhalant bedøvelsesmidler, der kan påvirke NALT. Ennesthesia kan bekræftes ved fraværet af refleksen reaktion på en blid klemning af tæerne. </li><li> Administrere 1 ml saltvand (0,9% natriumchloridinjektion USP) subkutant mellem skulderbladene anvendelse af en 22-28 gauge nål og sprøjte for at forhindre potentiel dehydratisering af mus efter kirurgi. Også administrere 0,1 ml Respiram subkutant mellem skulderbladene ved hjælp af en 22-28 gauge nål og sprøjte til at fremme en sund respiration under og efter operationen. </li><li> Tilvejebringe termisk støtte til mus under alle efterfølgende manipulationer. </li><li> Placere bedøvet mus i rygleje og anvende to separate løkker kirurgisk sutur omkring de øvre og nedre fortænder til forsigtigt lirke åben munding, og udsætter den øvre gane. </li><li> Anvende en nr. 11 kirurgisk blad at lave et snit omkring 3 mm i længde ned midterlinien af ​​den øvre gane i stedet for NALT. </li><li> Indsætte et 0,5 mm microcurette ind i indsnittet og forsigtigt skrabe under kanterne påforstyrre NALT. </li><li> Ætse snittet for at stoppe blødningen med en lige fin sløjfe på et termisk kautering enhed. </li><li> Fortsæt termisk støtte, mens musen genvinder til fuld bevidsthed og aktivitet. </li><li> Giv mus med saltvand subkutant op til tre gange om dagen, 1 ml pr injektion mellem skulderbladene, for at undgå dehydrering, som er nødvendigt, og oral smerte medicin en gang om dagen i 3 dage efter operationen. Bestem dehydrering ved at udføre en hud telt test for at kontrollere, om huden turgor. Fat hud og pels mellem skuldrene knivene, således at den telt op. Hvis huden hurtigt vender tilbage til normal, tidligere position, musen er ikke dehydreret. Hvis huden forbliver forhøjet og bevæger sig langsomt, musen er i en tilstand af dehydrering og kræver saltvand. Sørg våd mad i mindst tre dage efter operationen for at give tilstrækkelig tid til nyttiggørelse. </li><li> Forud for eventuelle eksperimentelle procedurer, observere musene for 8-10 dage ved at spore vægtøgning. Dårlig vægt opsvingnormalt indikerer ufuldstændig ganen healing, og disse mus skal trækkes tilbage fra yderligere undersøgelser. </li></ol> 3. Forberedelse NALT for Histologi og vurdering succes NALT Surgery <ol><li> Succes NALT kirurgi skal undersøges ved histologi som beskrevet nedenfor. Efter at have udfyldt alle eksperimentelle undersøgelser, forberede mus kranielle samlinger ved euthanizing anvendelse af godkendt IACUC vejledning. Undgå brug af inhalant bedøvelsesmidler, der kan påvirke NALT. </li><li> Fatte nakken af ​​aflivet mus. Fjern underkæbe fra resten af ​​kraniet ved at klippe gennem de kondylære processer med saks på begge sider. </li><li> Startende ved nakken, hud og pels fjerne fra kraniet ved langsomt skrælning og opskæring til den ventrale side af kraniet. </li><li> Forsigtigt fjernes huden omkring den nasale området og klippe skrællen af ​​spidsen af ​​tuden at fjerne helt. </li><li> Tag kraniet fra ryghvirvler witha klip af saksen. </li><li> Sæt saks i foramen magnum og skær halvvejs ned på kraniet langs midterlinjen for at tillade gennemtrængning af formalin i det bløde væv under fiksering. </li><li> Rette kraniet i 10% neutral pufret formalin (NBF) i 24 timer ved stuetemperatur. </li><li> At afkalke, placere prøven og separat kassette, pakket ind i gaze for at forhindre Rexyn fra at røre knoglerne, i flaske med myresyre blanding. Inkuber i 12 timer ved stuetemperatur, og derefter skylles kontinuerligt under rindende vand i cirka 20 minutter. </li><li> Trim prøven til skillevæggen og forbi øjet baner med et barberblad. </li><li> Sample og kassette kan gemmes til kortvarig i 10% NBF. </li><li> Anbring prøven på et væv processor natten over behandlingen. Dette gøres for at fjerne vand fra prøven forud for paraffin indlejring. </li><li> Fjern behandlet væv, integrere i et paraffin blok med snuden nedad, og lad den køle af. </li><li> Trim rough 15 um tværsnit af blokken med en automatiseret mikrotom, nærmer den omtrentlige placering af NALT, derefter fortsættes skære i 5 um snit til montering på objektglas i en 44,3 ° C vandbad. </li><li> Hematoxylin og eosin (H &amp; E) histologi farvning skal anvendes til at vurdere NALT ablation. </li></ol> 4. Indsamling af biologiske prøver fra Mus 4,1 Serum <ol><li> Forsigtigt at hæve kropstemperaturen med en varmelampe vil øge blodgennemstrømningen. Opsamle blod ved huldannelse den laterale halevene med en kirurgisk kniv. Tillade blodet at dryppe frit ind i en Microtainer serum separator rør. </li><li> Tryk forsigtigt til nick med absorberende materiale, såsom gaze eller håndklæde for at standse blodstrømmen. </li><li> Tillade blodet størkne i Microtainers i 30 minutter, centrifugeres mellem 6-15 x 1000 g i mindst 90 sekunder. </li><li> Overførsel separerede serum fra Microtainer til et rent Eppendorfrør foropbevaring ved -80 ° C. </li></ol> 4,2 Spyt <ol><li> Hold bedøvede mus lodret, mens pipettering 20-30 ul sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) mellem kinden og gummerne linie. Saml den fortyndede spyttet ved at lede pipettespids mellem kind og tandkødsranden. </li><li> Overføre fortyndede spyt til et frisk rør indeholdende 10 gl 2x proteaseinhibitor og opbevares ved -20 ° C. </li></ol> 4.3 næsesekreter <ol><li> Afliv mus før opsamling nasale sekreter, ved hjælp af godkendt IACUC vejledning. Undgå brug af inhalant bedøvelsesmidler, der kan påvirke NALT. </li><li> Hold musen lodret, omhyggeligt pipetteres 30 pi sterilt PBS i det ene næsebor og indsamle skyl fra andet næsebor. </li><li> Overførsel skylning til et frisk rør indeholdende 10 gl 2x proteaseinhibitor og opbevares ved -20 ° C. </li></ol> 4.4 vaginalsekret <ol><li> Spidsen af ​​en mikropipette ind i åbningen af ​​the vulva en aflivet mus, skylles vagina med 50 pi sterilt PBS og samle alle fluidum ved mikropipette. </li><li> Overførsel skylning til et frisk rør indeholdende 10 gl 2x proteaseinhibitor og opbevares ved -20 ° C. </li></ol> 5. Antigen-specifikke antistoffer eller cytokiner i de opsamlede prøver kan måles ved ELISA eller andre kvantitative metode. 6. Repræsentative resultater Figur 1 tilvejebringer en generel skematisk fremstilling af trinene, der er involveret i behandlingen af NALT-holdige væv til ex vivo-analyse. I figur 2 (A, B), er størrelsen af ganen vist, såvel som placeringen af snittet under ablation kirurgi (A) som angivet ved den stiplede linie. Placeringen af NALT er angivet med pile i præmolar området på en udskåret hematoxylin-farvet ganen i figur 2 (C), viser de parallelle væv. Figur 3viser trin i NALT forstyrrelser kirurgi, der viser eksponering af den øvre gane for adgang til NALT (A, B), ablation (C) og endelig kauterisering af snittet (D). En typisk H &amp; E tværsnit af den nasale sinus området omkring NALT før kirurgi er vist i figur 3E, medens et billede af NALT forstyrrelser af microcurette direkte efter operationen vises i figur 3F. Tillade tilstrækkelig tid til rekreation fra operation, bør indsnit lukkes og næsehulen blottet for NALT (figur 3G). Typiske eksperimentelle resultater opnået ved anvendelse af disse teknikker er vist i figur 4, sammenlignes vævskultursupernatanter og biologiske prøver fra en undersøgelse af en stafylokok-subunit vaccine (STEBVax). Mus blev administreret STEBVax ved intranasal (IN) eller intraperitoneale (IP) vej. Vaccinen blev formuleret med et adjuvans, som aktiverer Toll-lignende receptor 4 pathway 3,1<html> 4, og kontroller blev givet alene saltvand eller vaccine uden adjuvans. Dyrkede NALT opnået fra eksperimentelle grupper udskilte antigen-specifikke immunoglobuliner i medium, der var måles ved ELISA. I dette eksempel (fig. 4A), indikerer resultaterne, at de største mængder af IgA blev frigivet ved NALT opnået fra mus vaccineret IN med en subunit-vaccine kombineret med adjuvans. Biologiske prøver (såsom serum, spyt, nasale sekreter, vaginale sekretioner) erhvervet fra kontrol-eller NALT-frie mus kan anvendes til at profilere in vivo immunrespons på nasale antigener til sammenligning med vævskultur-resultaterne. I figur 4B, reaktioner IgA-og IgG til in vaccination blev signifikant reduceret uden funktionelle NALT. Niveauer af antigenspecifikt IgA var generelt større end IgG i mucosale sekretioner (spyt, nasale udskylninger) af vaccinerede mus. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Skematisk af NALT indsamling og ex vivo dyrkning. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figur 2. Visualisering af muse ganen angivelse af placeringen af NALT og kirurgi incision. Størrelsen og placeringen af ​​den øvre gane med kirurgi indsnit betegnet med den stiplede linie (A); øvre gane udskæres (B) eller farvet i hematoxylin (C) for at se den parallelle NALT i præmolar området gane (farvede mørk purpur til anterior side af ganen ). NALT angivet med pile. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figur 3. Kirurgisk NALT forstyrrelser. Vigtige stadier af NALT forstyrrelser operation: liggende opfattelse af musen øverste gane før operation (A); midtlinieincision foretaget på øverste ganen at få adgang til NALT (B); microcurette sonde indføres gennem midtlinieindsnit at afbryde NALT struktur itegrity (C); kauterisation af indsnit ved afslutningen af ​​kirurgi (D). Mikroskopiske billeder af næsehulen og H &amp; E-farvede, før kirurgi (E), umiddelbart efter operationen (F), og en succes helet, NALT-fri mus (G). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figur 4. Vaccine-specifikke antistoffer fra dyrkede NALT, spyt og nasale sekreter opsamlet fra vaccinerede mus. NALT-gratis eller normal kontrolmus blev vaccineret i eller IP med STEBVax, og biologiske prøver blev indsamlet. Antistofniveauer af tredobbelte prøver blev målt under anvendelse af ELISA. (A) NALT blev fjernet fra kontrolmus (ikke kirurgisk manipulation) og dyrket for at undersøge antistofresponser. Vaccinen-specifikke IgA-reaktion i kultur i vaccinerede mus var statistisk forskellig fra kontrol (Student t-test, p ≤ 0,01, sammenlignet med ingen adjuvans eller ingen vaccine). (B) NALT afbrydelse væsentligt reduceret specifikke antistofresponsertil IN vaccination. Der var signifikante forskelle mellem specifikke antistofniveauer NALT-og NALT + grupper (ingen kirurgi eller kontrol kirurgi) for alle sammenligninger med undtagelse spyt-IgG-resultaterne (Student t-test, p ≤ 0,05).

<ol>
	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li><li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li><li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT+(nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue)+in+the+rabbit.">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li><li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT):+frequency+and+localization+in+young+children.">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li><li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue:+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+naïve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site.">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li><li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses.">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li><li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue:+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus.">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li><li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium.">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li><li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lymphoid+tissue,+intranasal+immunization,+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system.">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li><li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT)+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+(LT+alpha)+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma,+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent.">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li><li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXC+chemokine+ligand+13,+CC+chemokine+ligand+(CCL)+19,+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li><li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome.">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Vi har præsenteret kollektive fremgangsmåder til udvikling af en dyremodel, opnåelse biologiske prøver, og assays til undersøgelse NALT-associerede immunresponser 1-4. Der er yderligere faktorer til at overveje, under udførelsen af ​​disse metoder. Standard sterile teknikker til kirurgi og vævskultur bør følges. En kombination af antibakterielle og svampedræbende midler, der anvendes under isolation og kultur, samt opretholdelse af steriliserede instrumenter, arbejdsområde og desinficerede ganer vil reducere risikoen for forurening. Spyt, nasal vaske og lignende mucosa-sekretion prøver bør undersøges for mulig kontaminering med blod, som serumantistoffer generelt fundet i højere koncentrationer. Endvidere bør slimhindesekreter kun svagt fortyndet til analyse på grund af lavere koncentrationer af antistoffer er til stede i disse prøver sammenlignet med serum. Mus holdes varme umiddelbart efter operation for at præudlufte potentiale anæstesi-induceret hypotermi. Alternative hvile mus på deres sider under post-kirurgi rekreation for at minimere uregelmæssig respiration. Den kirurgiske procedure er mere effektiv med tre personer, der arbejder sammen om at udføre disse opgaver: en udfører operationen, en til at hjælpe med at holde munden åben, og en til at give efter kirurgisk behandling, som musene komme fra bedøvelsen. Det er nødvendigt at bruge H &amp; E farvning af kranie tværsnit i slutningen af ​​alle eksperimentelle procedurer eller undersøgelser for at kontrollere succes operationen for hver mus. Mulige kirurgi resultater er: komplet og bilaterale NALT ablation, ufuldstændige ablation, eller intakt NALT. Fordi ikke alle operationer vil resultere i fuldstændig tab af NALT dyr med residual eller intakt NALT kan anvendes som interne kontroller. En anden potentiel resultat er, at ganen ikke fuldstændigt at helbrede, efterlader en åbning forbinder nasale og orale hulrum. Ufuldstændigheling af ganen vil resultere i lav vægt og manglende trivsel, og disse personer bør fjernes fra undersøgelser. Behandlingen vaccine responser først med musemodellen vil tjene til at etablere en rolle for NALT i den tilsigtede undersøgelsen resultatet (antistofrespons, overlevelse, etc.). Kirurgisk fjernelse af NALT letter bestemmelsen af ​​nasale bidrag til lokal og systemisk immunitet. Den kirurgiske fremgangsmåde, der beskrives her, er den mest direkte fremgangsmåde til opnåelse af en musemodel uden NALT. Vælge knock-out mus-modeller er blevet rapporteret at manglen NALT, men disse dyr også er deficiente i cytokiner eller chemokiner er afgørende for udvikling af andre sekundære lymfevæv, og kan huse yderligere fejl 12,13. Yderligere blev de her beskrevne metoder udviklet til undersøgelse af adskillige aspekter af immunresponser oprindelse i næsepassagerne. Vore eksperimentelle resultater er baseret på undersøgelser under anvendelse af hele den øvre palate fra mus til vævsdyrkning, selv om det er muligt, at sektionerne kan anvendes. Endelig dyrkede NALT model er anvendelig til udførelse af eksperimenter fuldstændigt i vævskultur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nr. </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Rustfrit stål Sterile Kirurgiske Blades, nr. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Kniv Håndtag, nr. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48-brønds cellekulturplader </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum, varmeinaktiveret </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Slutkoncentration: 10% efter volumen i dyrkningsmedier </td></tr><tr><td> Streptomycinsulfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Slutkoncentration: 100 ug / ml </td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Slutkoncentration: 100 UI / ml </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Slutkoncentration: 50 ug / ml </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Slutkoncentration: 1 ug / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Slutkoncentration: 10 mM </td></tr><tr><td> Eppendorf-mikrocentrifuge rør </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel kirsebæraroma Mouse Tørfoder </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-BAKKE </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Et fald på 1,5 mg / ml oral suspension </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Endelig CoNC: 6,06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acepromazin </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Slutkoncentration: 0,061 mg / mL </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Slutkoncentration: 0,667 mg / mL </td></tr><tr><td> Puralube Vet Salve </td><td> Pharmaderm Dyresundhed </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% Sodium Chloride Injection USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Termisk kautering Unit </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Udskiftning Tip, Straight Fin Loop </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Operationssaks </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% neutralbufret formalin </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Myresyre </td><td> Fisher </td><td> A119P-4 </td><td> Bland 426 ml myresyre i 1047 ml ledningsvand, og derefter tilsættes 45 ml Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Fisher </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Roterende mikrotom </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Mayers hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill No.1 Hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Separator </td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatbufret saltvand </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2PO 4, 140 mM NaCI, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-fri </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

De nasopharyngeal-associerede lymforetikulære væv (NALT) hos mennesker, gnavere, og andre pattedyr, bidrager til immunitet i de nasale bihuler 1-3. Den NALT to parallelle klokkeformede strukturer placeret i næsepassagerne ovennævnte den hårde gane og sædvanligvis betragtes som sekundære komponenter i slimhinde-associerede lymfoide system 4-6. Placeret inden i NALT er diskrete segmenter af B-og T-lymfocytter indflettet med antigen-præsenterende dendritiske celler 4,7,8. Disse celler er omgivet af en epithelcellelaget interkaleret med M-celler, som er ansvarlige for antigen hentning fra slimhindeoverfladerne i luftvejene 9,10. Naive lymfocytter cirkulerer gennem NALT er klar til at reagere på de første møder med respiratoriske patogener 7. Mens NALT forsvinder i mennesker i en alder af to år, Waldeyer ring og tilsvarende struktureret lymfeorganer Der er fortsat throughout levetid 6. I modsætning til mennesker fastholde mus NALT hele livet, hvilket således tilvejebringer en bekvem dyremodel til undersøgelse af immunreaktioner oprindelse i de nasale bihuler 11. Kulturer af enkelt-cellesuspensioner af NALT er ikke praktisk på grund af lave udbytter af mononukleære celler. Imidlertid kan NALT biologi undersøges ved ex vivo dyrkning af den intakte organ, og denne fremgangsmåde har den yderligere fordel at opretholde den naturlige vævsstruktur. For in vivo studier, er genetiske knockout-modeller udgør defekter begrænset til NALT i øjeblikket ikke tilgængelig på grund af en dårlig forståelse af udviklingsvejen. For eksempel, mens lymphotoxin-a-knockout-mus har atrofieret NALT er de Peyerske plaques, perifere lymfeknuder, follikulære dendritiske celler og andre lymfoide væv også ændres i disse genetisk manipulerede mus 12,13. Som et alternativ til gen-knockout-mus, kirurgisk ablation permanently eliminerer NALT fra nasal passage uden at påvirke andre væv. Den resulterende musemodel er blevet anvendt til at etablere forholdet mellem NALT og immunresponser på vacciner 1,3. Seriel indsamling af serum, spyt, nasale vaske og vaginale sekreter er nødvendig for at skabe grundlag for værtsresponser til vaccination, mens immunresponset oprindelse direkte fra NALT kan bekræftes ved vævskultur. Følgende procedurer skitsere de operationer, vævskultur og prøvetagning er nødvendige for at undersøge lokale og systemiske humorale immunrespons til intranasal (IN) vaccination.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Fremgangsmåder til at undersøge bidrag nasopharyngeal-associerede lymforetikulære væv (NALT) til nasal og systemiske immunresponser i mus til intranasale vacciner er beskrevet. Vi viser et kirurgisk indgreb for at etablere et NALT-afhængig musemodel og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kulturer af ekstraheret NALT.

Undersøge, hvilken rolle svælg-associeret lymforetikulære Tissue (NALT) i mus Responses til vacciner

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisering af Krampetrækning motilitet og karakterisering af rolle<em&gt; PilG</em&gt; i<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsigtet overvågning af inflammatoriske reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Immunisering af voksen zebrafisk for præklinisk Screening af DNA-baserede vacciner

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i Graft-versus-Host Sygdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...