Name: examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Ondersteuning werd geleverd door Becton Dickinson Technologies. Standpunten in dit indiening zijn die van de auteurs en geven niet de bedoeling om het officiële beleid van de Amerikaanse overheid te geven. Onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act en andere federale statuten en reglementen met betrekking tot dieren en experimenten met dieren en houdt zich aan principes vermeld in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, National Research Council, 1996. De faciliteit waar dit onderzoek werd uitgevoerd is geaccrediteerd volledig door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van het laboratorium Animal Care International.

1. Nalt Collection en het kweken <ol><li> Euthanaseren muizen met behulp van erkende IACUC begeleiding. Vermijd het gebruik van inhalatie-anesthetica die van invloed kunnen nalt. Overdracht muizen om een ​​aseptische werkruimte of bioveiligheid kast. Verwijder de onderkaak van de muis en reinig het gehemelte met alcohol en jodium doekjes. </li><li> Gebruik een nr. 11 chirurgische mes in chirurgische mes handvat zorgvuldig te snijden en accijnzen het gehemelte door het volgen van de binnenkant contour van de muis snijtanden en kiezen vast. </li><li> Haal voorzichtig terug in de mond met een pincet, zorg dat u het gehemelte scheuren. </li><li> Dit is noodzakelijk ter beperking van verontreiniging van culturen en is bestemd voor het verwerken van meerdere smaak. Place smaak in afzonderlijke putjes in de eerste kolom van een steriele 48-wells plaat voorgevuld met 250 pi complete kweekmedium (37 ° C), bestaande uit RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 pg / ml streptomycine, 100 UI / ml penicilline, 50 ug / ml gentamicineen 1 pg / ml fungizon / amfotericine. De media moeten carbonaat buffer als fijnproevers worden gekweekt in een 5% CO 2/95% vochtige lucht incubator (37 ° C), of als alternatief gebruik maken van 10 mM HEPES pH 7,4, voor niet-CO 2-cultuur. </li><li> Om de smaakpapillen te wassen, een tang om fijnproevers te verplaatsen naar elke volgende goed in een rij, zorgvuldig te tikken op de plaat tussen de wasbeurten, totdat het gehemelte heeft ondergaan een totaal van acht wasbeurten. </li><li> Breng het gehemelte een nieuwe steriele 48-wells plaat met 250 ul vers compleet cultuurmedium (37 ° C) in putten. </li><li> Plaats de platen die de smaak in een 37 ° C incubator voor het kweken van de duur van het onderzoek. </li><li> Verzamelen van monsters voor analyse door aseptisch overdracht 100 pi medium uit de cultuur putjes in Eppendorf buizen elke 24 uur vervangen met 100 ul vers 37 ° C kweekmedium. </li><li> Centrifugeer de kweekmedia monsters bij 380 g gedurende 10 minuten, 4 ° C, pellet vuil. </li><li> Breng het supernatans van de gecentrifugeerde monsters verse Eppendorf buizen en bewaren bij -20 ° C tot gebruik te analyseren. </li><li> Antigeen-specifieke IgG, IgM, IgA en of uitgescheiden cytokines worden gemeten in weefsel-kweeksupernatanten van standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). </li></ol> 2. Chirurgische ablatie van nalt <ol><li> Vrouw BALB / c muizen, 7 tot 9 weken oud zijn, zijn geschikt onderwerpen, maar ook andere stammen zijn ook aanvaardbaar. Zorg voor gel-achtige nat voer drie dagen voorafgaand aan een operatie om de muis wennen aan voedsel en water substituut dat zal worden toegediend na de operatie. </li><li> Dien een druppel Metacam verlichting van de pijn medicatie (1,5 mg / ml of 0,05 mg / drop) in de mondholte voorafgaand aan de operatie. </li><li> Verdoof muizen met behulp van erkende IACUC begeleiding, bijvoorbeeld met een ketamine, acepromazine, en xylazine mengsel (KAX) en breng Puralube Vet zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Vermijd het gebruik van inhalatie-anesthetica die van invloed kunnen nalt. Eennesthesia kan worden bevestigd door de afwezigheid van reflex reactie op een zacht knijpen van de tenen. </li><li> Dien 1 ml zoutoplossing (0,9% natriumchloride injectie USP) subcutaan tussen de schouderbladen met een 22-28 gauge naald en spuit om mogelijke uitdroging van de muis te voorkomen na de operatie. Ook subcutaan toedienen 0,1 ml van Respiram tussen de schouderbladen met een 22-28 gauge naald en spuit een gezonde ademhaling te bevorderen tijdens en na de operatie. </li><li> Zorg voor thermische ondersteuning van de muis tijdens alle volgende manipulaties. </li><li> Plaats de verdoofde muis in een liggende positie, en gebruik maken van twee aparte lussen van chirurgische hechtingen rond de bovenste en onderste snijtanden om voorzichtig los te wrikken open de mond, het blootstellen van het gehemelte. </li><li> Gebruik een nr. 11 chirurgische mes om een ​​incisie van ongeveer 3 mm in de lengte te maken beneden de middellijn van het gehemelte in de plaats van de nalt. </li><li> Plaats een 0,5 mm microcurette in de incisie en voorzichtig onder de randen schrapen omverstoren van de nalt. </li><li> Cauterize de incisie om het bloeden te stoppen met een rechte mooie lus op een thermische cauterisatie eenheid. </li><li> Ga door thermische ondersteuning terwijl de muis zich herstelt naar het volledige bewustzijn en activiteit. </li><li> Zorg voor de muis met een zoutoplossing subcutaan tot drie keer per dag, 1 ml per injectie tussen de schouderbladen, om uitdroging te voorkomen als nodig is en orale pijnstillers een keer per dag gedurende 3 dagen na de operatie. Bepaal uitdroging door het uitvoeren van een huid tent-test om te controleren op de huid turgor. Pak de huid en de vacht tussen de schouders messen zodat het tented op. Als de huid al snel terug naar de normale, vorige positie, de muis is niet uitgedroogd. Als de huid blijft verheven en beweegt zich langzaam, de muis is in een staat van uitdroging en vereist zoutoplossing. Zorg voor nat voedsel voor minstens drie dagen na de operatie voldoende tijd voor herstel mogelijk te maken. </li><li> Voorafgaand aan een experimentele procedures in acht muizen voor 8-10 dagen door het bijhouden van gewichtstoename. Slechte gewicht herstelmeestal geeft onvolledige gehemelte genezing, en deze muizen moet worden ingetrokken van verdere studies. </li></ol> 3. Voorbereiden nalt voor histologie en beoordeling van het welslagen van nalt Chirurgie <ol><li> Het succes van nalt operatie moet worden vastgesteld door histologie zoals hieronder beschreven. Na het voltooien van alle experimentele onderzoeken, voor te bereiden muizen voor craniale collecties van euthanasie met behulp van erkende IACUC begeleiding. Vermijd het gebruik van inhalatie-anesthetica die van invloed kunnen nalt. </li><li> Pak de nek van de hals van de euthanized muis. Verwijder de onderkaak van de rest van de schedel door knippen door de condylaire processen met een schaar aan beide zijden. </li><li> Begin bij de nek, verwijder de huid en vacht van de schedel door langzaam schillen en snijden van de richting van de ventrale zijde van de schedel. </li><li> Verwijder voorzichtig huid rond de neus-gebied en knip het vel van de punt van de snuit volledig te verwijderen. </li><li> Maak de schedel van de wervels witha knip van de schaar. </li><li> Plaats een schaar in het foramen magnum en snijd halverwege de schedel over de middellijn te doordringen van formaline kan in de zachte weefsels tijdens fixatie. </li><li> Fix schedel in 10% gebufferde formaline neutraal (NBF) gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Om ontkalken, plaats het monster en een aparte cassette, verpakt in gaas om Rexyn voorkomen dat het aanraken van het bot, in de fles met het mierenzuur mengsel. Incubeer gedurende 12 uur bij kamertemperatuur, vervolgens continu afspoelen met kraanwater voor ongeveer 20 minuten. </li><li> Knip het monster aan het septum en langs het oog banen met een scheermesje. </li><li> Steekproef en cassette kunnen worden opgeslagen voor de korte termijn in 10% NBF. </li><li> Plaats monster op een tissue-processor voor overnachting verwerking. Dit wordt gedaan om water te verwijderen uit het monster ter voorbereiding van paraffine inbedding. </li><li> Verwijder verwerkt weefsel, in te bedden in een paraffine blok met de snuit naar beneden en laat hem afkoelen. </li><li> Trim rdoorgedreven 15 micrometer doorsnede van het blok met een geautomatiseerde microtoom, het naderen van de geschatte locatie van de nalt, ga dan verder snijden in 5 micrometer secties voor montage op glas dia&#39;s in een 44,3 ° C waterbad. </li><li> Hematoxyline en eosine (H &amp; E) histologie kleuring worden gebruikt om nalt ablatie beoordelen. </li></ol> 4. Het verzamelen van biologische monsters van Muizen 4,1 Serum <ol><li> Voorzichtig verhogen van de lichaamstemperatuur met een warmte-lamp zal toenemen bloedstroom. Verzamel bloed door inkeping de laterale staartader met een chirurgisch mes. Laat het bloed vrij te druppelen in een Microtainer serum separator buis. </li><li> Pas lichte druk naar nick met absorberend materiaal, zoals gaas of een handdoek, om de bloedstroom te stoppen. </li><li> Laat het bloed te stollen in de Microtainers gedurende 30 minuten en centrifugeer 6-15 x 1.000 g gedurende minstens 90 seconden. </li><li> Transfer gescheiden serum van Microtainer in een schone Eppendorf buisopslag bij -80 ° C. </li></ol> 4,2 Speeksel <ol><li> Verticaal Houd de verdoofde muis terwijl pipetteren 20-30 ul steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tussen de wang en tandvlees. Verzamel de verdunde speeksel door het richten pipetpunt tussen wang en tandvlees. </li><li> Breng de verdunde speeksel naar een nieuwe buis met 10 pi 2x proteaseremmer en bij -20 ° C. </li></ol> 4,3 neusafscheidingen <ol><li> Euthanaseren muis voor het verzamelen van nasale secreties, met behulp van goedgekeurde IACUC begeleiding. Vermijd het gebruik van inhalatie-anesthetica die van invloed kunnen nalt. </li><li> Houd de muis verticaal, zorgvuldig pipetteer 30 pi van steriele PBS in een neusgat en het verzamelen van spoelen van andere neusgat. </li><li> Breng spoelen naar een nieuwe buis met 10 pi 2x proteaseremmer en bij -20 ° C. </li></ol> 4,4 Vaginale afscheiding <ol><li> Steek de punt van een micropipet in de opening van ee vulva van een euthanized muis, spoelen de vagina met 50 ul van steriele PBS en verzamel alle vloeistof door micropipet. </li><li> Breng spoelen naar een nieuwe buis met 10 pi 2x proteaseremmer en bij -20 ° C. </li></ol> 5. Antigeen-specifieke antilichamen of cytokines in de verzamelde kan worden gemeten met ELISA of een andere kwantitatieve methode. 6. Representatieve resultaten Figuur 1 geeft een algemeen schema van stappen met de verwerking van nalt bevattende weefsel voor ex vivo analyse. In figuur 2 (A, B), wordt de grootte van het gehemelte weergegeven, alsmede de plaats van de snede in ablatie operatie (A), zoals aangegeven door de stippellijn. De locatie van nalt aangegeven door pijlen in de premolaar gebied in een uitgesneden hematoxyline gebeitst smaak in figuur 2 (C), met de parallelle weefsels. Figuur 3geeft stappen van de nalt verstoring operatie met blootstelling van het gehemelte toegang tot nalt (A, B), ablatie (C), en laatste cauterisatie van de insnijding (D). Een typische H &amp; E doorsnede van de neus sinus omgeving van het nalt vóór de operatie is weergegeven in figuur 3E, terwijl een beeld van nalt verstoring van de microcurette direct na chirurgie weergegeven in figuur 3F. Voldoende tijd voor herstel van een operatie, moet de incisies worden gesloten en de neusholte zonder nalt (figuur 3G). Typische experimentele resultaten verkregen met behulp van deze technieken worden getoond in Figuur 4, vergeleken weefselkweek supernatanten biologische monsters van een onderzoek van Staphylococcus subunit vaccin (STEBVax). Muizen werden toegediend STEBVax door intranasale (IN) of intraperitoneale (IP) routes. Het vaccin werd ontwikkeld met een adjuvans dat de Toll-like receptor 4 weg 3,1 activeert<html> 4, en controles kregen alleen een zoutoplossing of vaccin zonder adjuvans. Gekweekte nalt verkregen uit experimentele groepen uitgescheiden antigeen-specifieke immunoglobulinen in het medium dat was meetbaar met behulp van ELISA. In dit voorbeeld (figuur 4A) De resultaten geven aan dat de grootste hoeveelheid IgA werden door nalt verkregen uit muizen ingeënt met subunit vaccin met adjuvans. Biologische monsters (zoals serum, speeksel, neusafscheiding vaginale afscheiding) verkregen van de stuur nalt vrij muizen kunnen worden gebruikt om het profiel van de in vivo immuunrespons tegen nasale antigenen te vergelijken met de resultaten weefselkweek. In figuur 4B, IgA en IgG reacties aan in vaccinatie aanzienlijk gedaald zonder functionele nalt. Niveaus van antigeen-specifieke IgA waren over het algemeen groter dan IgG in mucosale secreties (speeksel, neus wasbeurten) van de gevaccineerde muizen. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Schematische voorstelling van nalt verzamelen en ex vivo kweken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figuur 2. Visualisatie van de muis gehemelte die de positie van nalt en chirurgie incisie. Grootte en de locatie van de bovenste gehemelte met een operatie incisie aangegeven met stippellijn (A); gehemelte weggesneden (B) of gekleurd in hematoxyline (C) om de parallelle nalt bekijken in de premolaar gebied van gehemelte (donker gebeitst paars op voorzijde van gehemelte ). Nalt pijlen aangegeven. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figuur 3. Chirurgische nalt verstoring. Belangrijkste fasen van nalt verstoring chirurgie: rugligging van de muis gehemelte vóór de operatie (A); middellijn incisie gemaakt op de bovenste gehemelte aan de nalt (B) toegang te krijgen; microcurette sonde ingebracht via middellijn incisie aan nalt structuur verstoren integrity (C); cauterisatie van de incisie bij afsluiting van een operatie (D). Microscopische beelden van de neusholten, H &amp; E gekleurd, voor de operatie (E) en onmiddellijk na de operatie (F) en een succesvol genezen, nalt-vrije muis (G). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figuur 4. Vaccin-specifieke antilichamen van gekweekte nalt, speeksel, en nasale afscheidingen afkomstig van gevaccineerde muizen. Nalt-vrij of normale controle muizen werden gevaccineerd in of IP met STEBVax, en biologische monsters werden verzameld. Antilichamen voor van drie monsters werden gemeten met ELISA. (A) nalt werden verwijderd zijn van de controle muizen (niet chirurgisch gemanipuleerd) en gekweekt om antilichaamrespons te onderzoeken. Het vaccin-specifieke IgA respons in cultuur voor bij gevaccineerde muizen was statistisch significant verschillend van controles (Student&#39;s t-test, p ≤ 0,01, vergeleken met geen adjuvante of geen vaccin). (B) nalt verstoring aanzienlijk minder specifieke antilichaamresponsop IN vaccinatie. Er waren significante verschillen tussen specifieke antilichaam niveaus van nalt-en nalt + groepen (zonder chirurgie of controle chirurgie) voor alle vergelijkingen behalve speeksel IgG resultaten (Student&#39;s t-test, p ≤ 0,05).

<ol>
	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li><li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li><li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT+(nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue)+in+the+rabbit.">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li><li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT):+frequency+and+localization+in+young+children.">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li><li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue:+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+naïve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site.">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li><li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses.">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li><li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue:+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus.">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li><li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium.">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li><li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lymphoid+tissue,+intranasal+immunization,+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system.">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li><li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT)+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+(LT+alpha)+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma,+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent.">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li><li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXC+chemokine+ligand+13,+CC+chemokine+ligand+(CCL)+19,+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li><li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome.">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben gepresenteerd collectieve methoden voor het ontwikkelen van een diermodel, het verkrijgen van biologische monsters en testen voor de behandeling van nalt-geassocieerde immuunreacties 1-4. Er zijn bijkomende factoren te overwegen tijdens de uitvoering van deze methoden. Standaard steriele technieken voor de operatie en weefselkweek moeten worden opgevolgd. Een combinatie van antibacteriële en schimmelwerende middelen die worden gebruikt tijdens de isolatie en cultuur, alsmede het onderhouden van gesteriliseerde instrumenten, het werkgebied, en ontsmet fijnproevers zullen verminderen het risico op besmetting. Speeksel, nasale wast en soortgelijke mucosale secretie monsters moeten worden gecontroleerd op mogelijke besmetting met bloed, als serum-antilichamen worden over het algemeen te vinden in hogere concentraties. Verder moet mucosale afscheiding slechts licht verdund analyse door lagere concentraties van antilichamen aanwezig in deze monsters opzichte van serum. Muizen moeten warm gehouden worden direct na de operatie aan voorafraat helpt mogelijke anesthesie-geïnduceerde hypothermie. Alternate rust muizen op hun kant tijdens post-operatie recuperatie om onregelmatige ademhaling te minimaliseren. De chirurgische ingreep is efficiënter met drie personen samen te werken om deze taken uit te voeren: een uitvoering van de operatie, een om te helpen bij houden van de mond open, en een voor post-operatieve zorg te verlenen als de muizen te herstellen van anesthesie. Het is noodzakelijk H &amp; E kleuring van hersen doorsneden gebruikt eind alle experimentele procedures of studies het succes van de operatie voor elke muis verifiëren. Mogelijke operatie resultaten zijn: compleet en bilaterale nalt ablatie, onvolledige ablatie, of intacte nalt. Omdat niet alle operaties leidt volledig verlies van de nalt dieren met resterende intacte of nalt kan worden gebruikt als controle. Een ander potentieel resultaat is dat de mond niet volledig genezen, waardoor een opening aansluiten van de neus en de orale holten. Onvollediggenezing van het gehemelte zal resulteren in een laag gewicht en het nalaten te bloeien, en deze mensen moeten worden verwijderd uit studies. Onderzoek vaccin responsen eerst met muismodel dienen om een ​​rol nalt stellen in het beoogde resultaat studie (antilichaamrespons overleving, etc.). Operatieve verwijdering van de nalt vergemakkelijkt het bepalen van de neus bijdragen aan de lokale en systemische immuniteit. De chirurgische aanpak die hier beschreven is de meest directe methode voor het verkrijgen van een muis model zonder nalt. Selecteer knock-out muismodellen zijn gemeld aan een gebrek nalt, maar deze dieren ook een tekort aan cytokinen of chemokinen essentieel voor de ontwikkeling van andere secundaire lymfoïde weefsels, en zij kunnen drager extra defecten 12,13. Verder werden de hier beschreven methoden ontwikkeld voor de behandeling van verschillende aspecten van de immuunrespons van oorsprong uit de neus. Onze experimentele resultaten zijn gebaseerd op studies met behulp van de gehele bovenste palate van de muis weefselkweek, hoewel het mogelijk dat delen worden gebruikt. Ten slotte gekweekte nalt model is nuttig voor het uitvoeren van proeven geheel in weefselkweek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RVS steriele chirurgische mesjes, nr. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Handgreep, nr. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48 en Cell Culture platen </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum, Heat geïnactiveerd </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Laatste Conc: 10% van het volume in de cultuur media </td></tr><tr><td> Streptomycine sulfaat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Final Conc: 100 pg / ml </td></tr><tr><td> Penicilline </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Laatste Conc: 100 UI / ml </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Final Conc: 50 ug / ml </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Final Conc: 1 pg / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Laatste Conc: 10 mM </td></tr><tr><td> Eppendorf Reactievaatjes </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel kersensmaak Mouse natvoer </td><td> Bio-Dien </td><td> S4798-LADE </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Een druppel van 1,5 mg / ml orale suspensie </td></tr><tr><td> Ketamine </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Final Conc: 6,06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Laatste Conc: 0,061 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Laatste Conc: 0,667 mg / ml </td></tr><tr><td> Puralube Vet Zalf </td><td> Pharmaderm Animal Health </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% natriumchloride voor injectie USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Thermische cauterisatie Unit </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Vervanging Tip, Straight Fine Loop </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische schaar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% neutraal gebufferde formaline </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Mierenzuur </td><td> Visser </td><td> A119P-4 </td><td> Meng 426 ml mierenzuur in 1047 ml water uit de kraan en voeg dan 45 ml Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Visser </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rotatiemicrotoom </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Mayer&#39;s Hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill No.1 Hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Separator </td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Proteaseremmer Cocktail, EDTA-vrij </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

De nasopharyngeal-geassocieerde lymforeticulaire weefsels (nalt) gevonden worden bij mensen, knaagdieren en andere zoogdieren, bijdragen aan de immuniteit in de nasale sinussen 1-3. De nalt zijn twee parallelle klok-vormige structuren in de neus boven het harde gehemelte, en worden meestal beschouwd als secundaire componenten van het mucosale-geassocieerde lymfoïde systeem 4-6. Ligt in het nalt zijn discrete compartimenten van B en T-lymfocyten afgewisseld met antigeen-presenterende dendritische cellen 4,7,8. Deze cellen zijn omgeven door een epitheelcellen laag geïntercaleerd met M-cellen die verantwoordelijk zijn voor antigenen van de slijmvliezen van de luchtwegen 9,10. Naïeve lymfocyten circuleren door het nalt zijn klaar om de eerste ontmoetingen reageren met respiratoire pathogenen 7. Terwijl nalt verdwijnen bij de mens door de leeftijd van twee jaar, de Waldeyer de Ring en op soortgelijke wijze gestructureerde lymfatische organen blijven ste blijven bestaanroughout leven 6. In tegenstelling tot mensen, muizen behouden nalt gedurende het hele leven, en zo een handige diermodel voor de studie van de immuunrespons van oorsprong uit de neusbijholten 11. Cultures van enkele-celsuspensies van nalt niet praktisch vanwege de lage opbrengst van mononucleaire cellen. Echter, nalt biologie worden onderzocht door ex vivo kweken van de intacte orgaan, en deze methode heeft het bijkomende voordeel van behoud van de natuurlijke weefselstructuur. Voor de in vivo studies, genetische knock-out modellen presenteren gebreken beperkt tot nalt zijn momenteel niet beschikbaar als gevolg van een slecht begrip van de ontwikkeling pad. Bijvoorbeeld, terwijl lymfotoxine-α knockout muizen afgestorven nalt worden de plaques van Peyer, perifere lymfknopen, folliculaire dendritische cellen en andere lymfoïde weefsel ook veranderd in deze genetisch gemanipuleerde muizen 12,13. Als alternatief voor de knockout muizen, chirurgische ablatie permanently elimineert nalt uit de neusholte, zonder dat andere weefsels. De resulterende muis model is gebruikt om de relaties tussen nalt en de immuunrespons op vaccins 1,3 vast te stellen. Serial verzameling van het serum, speeksel, neus wast en vaginale afscheiding is nodig voor het vaststellen van de hand van gastheer responsen tegen vaccinatie, terwijl de immuunrespons rechtstreeks afkomstig nalt kan worden bevestigd door weefselkweek. De volgende procedures een overzicht van de operaties, weefselkweek en monstername nodig is om lokale en systemische humorale immuunrespons op intranasale (IN) vaccinatie te onderzoeken.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methoden om bijdragen van de nasofaryngeale-geassocieerde lymforeticulaire weefsels (nalt) naar neus-en systemische immuunrespons van muizen voor intranasale vaccins te onderzoeken beschreven. We tonen een chirurgische ingreep om een ​​nalt-afhankelijke muis model vast te stellen en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Culturen van gewonnen nalt.

Het onderzoeken van de rol van Nasopharyngeal-geassocieerde lymforeticulaire Tissue (nalt) in de muis reacties op vaccins

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de<em&gt; PilG</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em&gt; In Vivo</em&gt; Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpressie en zuivering van het menselijk<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Immunisatie van volwassen Zebrafish voor de preklinische Screening van DNA-gebaseerde vaccins

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...