Name: examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Støtte ble gitt av Becton Dickinson Technologies. Synspunkter som uttrykkes i dette brevet er de av forfatterne, og ikke til hensikt å reflektere offisiell politikk av amerikanske myndigheter. Forskningen ble gjennomført i samsvar med dyrevernloven og andre føderale lover og forskrifter knyttet til dyr og eksperimenter som involverer dyr og følger prinsippene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, National Research Council, 1996. Anlegget der denne forskningen ble utført er fullt akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. NALT Innsamling og dyrkning <ol><li> Avlive mus ved hjelp av godkjent IACUC veiledning. Unngå bruk av sniffestoffer anestetika som kan påvirke NALT. Overfør mus til en aseptisk arbeidsområdet eller biosikkerhet skap. Fjern den nedre kjeven av mus og rengjøre øvre gane området med alkohol og jod våtservietter. </li><li> Bruk en nr. 11 kirurgisk blad i kirurgisk knivskaftet å nøye klippe og avgiftsdirektoratet øvre gane ved å følge innsiden konturen av mus fortenner og molar tenner. </li><li> Forsiktig skrelle tilbake ganen med tang, være forsiktig med å rive ganen. </li><li> Dette trinnet er nødvendig for å redusere forurensning av kulturer og er designet for å prosessere flere ganer. Plasser ganer i enkelte brønner i den første kolonnen i et sterilt 48-brønns plate forhåndsutfylt med 250 mL av komplett kultur medium (37 ° C) bestående av RPMI 1640 supplert med 10% fosterets bovint serum, 100 mikrogram / ml streptomycin, 100 UI / ml penicillin, 50 mikrogram / ml gentamicinog 1 mikrogram / ml fungizone / amfotericin. Media bør være karbonat buffer hvis ganer dyrkes i en 5% CO 2/95% fuktig luft inkubator (37 ° C), eller alternativt bruke 10 mM HEPES pH 7,4, for ikke-CO 2 kultur. </li><li> Å vaske ganer, bruke tang til å flytte ganer i hver påfølgende brønn i en rad, forsiktig trykke platen mellom hver vask, før ganen har gjennomgått en totalt åtte vask. </li><li> Overfør ganer i en ny steril 48-brønns plate inneholder 250 mL av fersk, komplett kultur medium (37 ° C) i brønner. </li><li> Plasser platene inneholder ganer i en 37 ° C inkubator for dyrking for varigheten av studien. </li><li> Samle inn prøver for analyse av aseptisk overføring 100 mL av medium fra kultur brønner inn i Eppendorf rør hver 24. time, og erstatter med 100 mL frisk 37 ° C kultur medium. </li><li> Sentrifuger vekstmedium prøvene ved 380 xg i 10 minutter, 4 ° C, pellet rusk. </li><li> Overfør supernatanten fra sentrifugert prøve til ferske Eppendorf-rør og oppbevares ved -20 ° C til den er klar til å analysere. </li><li> Antigen-spesifikke IgG, IgM og IgA, eller skilles ut cytokiner blir målt i vev-kultur supernatants av standard enzym-tilknyttede immunosorbent assays (ELISA). </li></ol> 2. Kirurgisk ablasjon av NALT <ol><li> Kvinnelige BALB / c mus, 7 til 9 ukers alder, er egnet fag, men andre stammer er også akseptabelt. Gi gel-lignende våt mat tre dager før kirurgi for å akklimatisere musen til mat og vann erstatning som vil bli administrert etter operasjonen. </li><li> Administrere en dråpe Metacam smerte lindring medisiner (1,5 mg / ml eller 0,05 mg / drop) inn i munnhulen før operasjonen. </li><li> Anesthetize mus med godkjent IACUC veiledning, for eksempel med en ketamin, acepromazine, og xylazin blanding (KAX) og påfør Puralube Vet salve på øynene for å hindre uttørking. Unngå bruk av sniffestoffer anestetika som kan påvirke NALT. Anesthesia kan bekreftes ved fravær av refleks svar på en skånsom klem av tærne. </li><li> Administrer 1 ml saltvannsoppløsning (0,9% natriumklorid injeksjonsvæske USP) subkutant mellom skulderbladene med en 22-28 gauge kanyle og sprøyte for å forhindre potensielle dehydrering av musen etter operasjonen. Også administrere 0,1 mL Respiram subkutant mellom skulderbladene med en 22-28 gauge kanyle og sprøyte for å fremme sunn åndedrett under og etter operasjonen. </li><li> Gi termisk støtte til musen i alle senere manipulasjoner. </li><li> Plasser bedøvet musen i en liggende stilling, og bruke to separate sløyfer med kirurgisk sutur rundt de øvre og nedre fortenner å forsiktig lirke åpen munn, utsette den øvre gane. </li><li> Bruk en nr. 11 kirurgisk kniv for å gjøre et snitt på ca 3 mm i lengde ned midtlinjen av øvre gane i stedet av NALT. </li><li> Sett inn en 0,5 mm microcurette i snittet og forsiktig skrape under kantene tilforstyrre NALT. </li><li> Cauterize snittet for å stoppe blødningen med en rett fin sløyfe på en termisk elektrokirurgi enhet. </li><li> Fortsett termisk støtte mens mus gjenvinner til full bevissthet og aktivitet. </li><li> Gi mus med saltvann subkutant opptil tre ganger om dagen, 1 ml per injeksjon mellom skulderbladene, for å forhindre dehydrering som nødvendig og oral smerte medisinering gang daglig i 3 dager etter operasjonen. Bestem dehydrering ved å utføre en hud telt test for å sjekke huden turgor. Ta tak i hud og pels mellom skuldre bladene slik at det er telt opp. Hvis huden raskt tilbake til normal, forrige stilling, er musen ikke dehydrert. Hvis huden forblir forhøyet og beveger seg sakte, er musen i en tilstand av dehydrering og krever saltvann. Gi våt mat i minst tre dager etter operasjonen for å gi tilstrekkelig tid til restitusjon. </li><li> Før eventuelle eksperimentelle prosedyrer, observere mus for 8-10 dager ved å spore vektøkning. Dårlig vekt utvinningvanligvis indikerer ufullstendig gane healing, og disse musene skal trekkes fra videre studier. </li></ol> 3. Forbereder NALT for histologi og vurdere suksessen NALT Surgery <ol><li> Suksessen til NALT kirurgi må avklares med histologi som beskrevet nedenfor. Etter å ha fullført alle eksperimentelle studier, forberede mus for kraniale samlinger ved euthanizing bruke godkjent IACUC veiledning. Unngå bruk av sniffestoffer anestetika som kan påvirke NALT. </li><li> Ta tak i nakken på avlives musen. Fjern den nedre kjeven fra resten av skallen ved snipping gjennom condylar prosesser med saks på begge sider. </li><li> Starter ved nakken, fjern skinnet og pelsen fra hodeskallen ved sakte skrelling og kutting mot ventrale siden av kraniet. </li><li> Fjern forsiktig huden rundt nese området og klipp huden ut av snutespissen å fjerne helt. </li><li> Løsne kraniet fra ryggvirvlene viddha avklipt av saksen. </li><li> Sett saks inn i foramen magnum og kuttet halvveis nedover kraniet langs midtlinjen å tillate infiltrasjon av formalin i det myke vevet under fiksering. </li><li> Fastsette kraniet i 10% nøytral bufret formalin (NBF) i 24 timer ved romtemperatur. </li><li> For å avkalke, plassere prøven og separat kassett, innpakket i gasbind for å hindre Rexyn fra berøre bein, i flaske med maursyre blandingen. Inkuber i 12 timer ved romtemperatur, og deretter skylle kontinuerlig under springen vann i ca 20 minutter. </li><li> Trim prøven til septum og forbi øyet baner med et barberblad. </li><li> Utvalg og kassett kan lagres for kortsiktig i 10% NBF. </li><li> Plasser prøven på en vev prosessor for overnatting behandling. Dette gjøres for å fjerne vann fra prøven i forberedelse til parafin embedding. </li><li> Fjern behandlet vev, bygge inn i en parafin blokk med snuten ned, og la den avkjøles. </li><li> Trim rough 15 mikrometer tverrsnitt av blokken med en automatisert mikrotom, nærmer den omtrentlige plasseringen av NALT, deretter fortsette å kutte i 5 mikrometer seksjoner for montering på glassplater i en 44,3 ° C vannbad. </li><li> Hematoxylin og eosin (H &amp; E) histologi farging bør brukes til å vurdere NALT ablasjon. </li></ol> 4. Innsamling av biologiske prøver fra mus 4,1 Serum <ol><li> Nøye heve kroppstemperaturen med en varmelampe vil øke blodgjennomstrømningen. Samle blod ved nicking den laterale halen venen med en kirurgisk kniv. La blodet renne fritt inn i en Microtainer serum separator tube. </li><li> Bruk milde press til nick med absorberende materiale, for eksempel gasbind eller håndkle for å stoppe blod flyte. </li><li> La blodet å koagulere i Microtainers i 30 minutter, deretter sentrifuger mellom 6-15 x 1000 g i minst 90 sekunder. </li><li> Transfer Serum fra Microtainer i en ren Eppendorf rør forlagring ved -80 ° C. </li></ol> 4.2 Spytt <ol><li> Hold bedøvet musen vertikalt mens pipettering 20-30 mL sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) mellom kinnet og tannkjøttet. Samle utvannet spytt ved å dirigere pipettespissen mellom kinnet og tannkjøttet. </li><li> Overfør utvannet spytt til en frisk tube inneholder 10 mL av 2x proteasehemmer og oppbevar ved -20 ° C. </li></ol> 4.3 nesesekreter <ol><li> Avlive mus før innsamling nesesekreter, bruk godkjent IACUC veiledning. Unngå bruk av sniffestoffer anestetika som kan påvirke NALT. </li><li> Hold musen vertikalt, nøye pipetter 30 mL sterilt PBS i det ene neseboret og samle skyll fra andre neseboret. </li><li> Overfør skyll til en frisk tube inneholder 10 mL av 2x proteasehemmer og oppbevar ved -20 ° C. </li></ol> 4.4 skjedesekret <ol><li> Sett tuppen av en mikropipette inn i åpningen av the vulva av en avlives mus, skyll skjeden med 50 mL sterilt PBS og samle all væske ved mikropipette. </li><li> Overfør skyll til en frisk tube inneholder 10 mL av 2x proteasehemmer og oppbevar ved -20 ° C. </li></ol> 5. Antigen-spesifikke antistoffer eller cytokiner i de innsamlede prøvene kan måles ved ELISA eller annen kvantitativ metode. 6. Representative Resultater Figur 1 gir en generell skjematisk av trinnene involvert med å behandle NALT-holdig vev for ex vivo analyse. I figur 2 (A, B), er størrelsen på ganen vist, samt plasseringen av snittet under ablasjon kirurgi (A), som indikert av den stiplede linjen. Plasseringen av NALT er markert med piler i premolar-området på en excised hematoxylin-beiset gane i figur 2 (C), som viser de parallelle vev. Figur 3presenterer trinnene i NALT avbrudd operasjonen, viser eksponering av øvre gane for tilgang til NALT (A, B), ablasjon (C), og endelig cauterization av snitt (D). En typisk H &amp; E tverrsnitt av den nasale sinus området rundt NALT før operasjonen er vist i Figur 3E, mens et bilde av NALT avbrudd av microcurette direkte etter operasjonen vises i Figur 3F. Hensyntatt tilstrekkelig tid til restitusjon fra kirurgi, bør snittene lukkes og nesehulen blottet for NALT (Figur 3G). Typiske eksperimentelle resultater oppnådd ved hjelp av disse teknikkene er vist i figur 4, sammenligne vevskulturstudier supernatants og biologiske prøver fra en studie av en stafylokokk subenhet vaksine (STEBVax). Musene ble administrert STEBVax av intranasal (IN) eller intraperitoneal (IP) ruter. Vaksinen ble formulert med en adjuvans som aktiverer Toll-like receptor 4 veien 3,1<html> 4, og kontroller ble gitt bare saltvann eller vaksine uten adjuvans. Helstøpt NALT hentet fra eksperimentelle grupper skilles antigen-spesifikke immunglobuliner til mediet som var målbar med ELISA. I dette eksemplet (figur 4A), tyder resultatene på at de største mengder IgA ble utgitt av NALT hentet fra mus vaksinert i med en subenhet vaksine kombinert med adjuvans. Biologiske prøver (for eksempel serum, spytt, nesesekreter, vaginal sekret) kjøpt fra kontroll eller NALT-frie mus kan brukes til å profilere in vivo immunrespons nasale antigener for sammenligning med de vevskulturstudier resultatene. I Figur 4B, IgA og IgG svar i vaksinasjonsprogrammer ble betydelig redusert uten funksjonell NALT. Nivåer av antigen-spesifikke IgA var generelt større enn IgG i slimhinnene sekreter (spytt, nasal vask) av de vaksinerte mus. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Skjematisk av NALT innsamling og ex vivo dyrkning. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figur 2. Visualisering av musen gane viser plasseringen av NALT og kirurgi snitt. Størrelse og plassering av øvre gane med kirurgi snitt merket med stiplet linje (A); øvre gane excised (B) eller beiset i hematoxylin (C) for å vise den parallelle NALT i premolar-området i ganen (beiset mørke lilla på fremre side av ganen ). NALT angitt med piler. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figur 3. Kirurgisk NALT avbrudd. Viktige stadier av NALT avbrudd kirurgi: liggende visning av mus øvre gane før kirurgi (A); midtlinjen innsnitt gjort på øvre gane for å få tilgang til NALT (B); microcurette sonden inn gjennom midtlinjen snitt til å forstyrre NALT struktur itegrity (C); cauterization av snitt ved avslutningen av kirurgi (D). Mikroskopiske bilder av nesehulene, H &amp; E beiset, før kirurgi (E), umiddelbart etter operasjonen (F), og en vellykket helbredet, NALT uten mus (G). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figur 4. Vaksine-spesifikke antistoffer fra kultivert NALT, spytt, og nesesekreter hentet fra vaksinerte mus. NALT-free eller normal kontroll mus ble vaksinert i eller IP med STEBVax, og biologiske prøver ble samlet inn. Antistoff nivåer av tre eksemplarer prøvene ble målt ved hjelp av ELISA. (A) NALT ble fjernet fra kontroll mus (ikke kirurgisk manipulerte) og dyrkes for å undersøke antistoffresponsen. Vaksinen-spesifikke IgA respons på kultur for hos vaksinerte musene var statistisk forskjellig fra kontroller (Student t-test, p ≤ 0,01, sammenlignet med ingen adjuvant eller ingen vaksine). (B) NALT avbrudd vesentlig redusert spesifikke antistoffresponsentil IN vaksinasjon. Det var signifikante forskjeller mellom spesifikt antistoff nivåer av NALT-og NALT + grupper (ingen kirurgi eller kontroll kirurgi) for alle sammenligninger unntatt spytt IgG resultater (Student t-test, p ≤ 0,05).

<ol>
	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li><li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li><li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT+(nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue)+in+the+rabbit.">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li><li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT):+frequency+and+localization+in+young+children.">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li><li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue:+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+naïve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site.">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li><li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses.">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li><li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue:+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus.">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li><li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium.">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li><li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lymphoid+tissue,+intranasal+immunization,+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system.">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li><li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT)+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+(LT+alpha)+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma,+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent.">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li><li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXC+chemokine+ligand+13,+CC+chemokine+ligand+(CCL)+19,+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li><li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome.">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Vi har presentert kollektive metoder for å utvikle en dyremodell, skaffe biologiske prøver, og analyser for å undersøke NALT-tilknyttede immunresponser 1-4. Det er flere faktorer å vurdere under utførelsen av disse metodene. Standard sterile teknikker for kirurgi og vev kultur bør følges. En kombinasjon av antibakterielle og soppdrepende midler brukes under isolasjon og kultur, samt opprettholde steriliserte instrumenter, arbeidsområde, og desinfiserte ganespalter vil redusere risikoen for forurensning. Spytt, nasale vasker og lignende mucosal sekret prøver skal inspiseres for å smitte via blod, som serum-antistoffer er vanligvis funnet i høyere konsentrasjoner. Videre bør mucosal sekreter bare litt utvannet for analysen fordi lavere konsentrasjoner av antistoffer er til stede i disse prøvene sammenlignet med serum. Mus må holdes varm rett etter operasjonen for å preventilere potensiell anestesi-indusert hypotermi. Alternative hvilende musene på sine sider i løpet av postoperative rekonvalesens å minimere uregelmessig åndedrett. Den kirurgiske prosedyren er mer effektiv med tre personer som arbeider sammen for å fullføre disse oppgavene: en utfører operasjonen, en for å bistå i å holde munnen åpen, og en for å gi postoperativ behandling som musene gjenopprette fra anestesi. Det er nødvendig å bruke H &amp; E farging av kraniale tverrsnitt på slutten av alle eksperimentelle prosedyrer eller undersøkelser for å verifisere suksess for kirurgi for hver mus. Mulige kirurgi utfall er: komplett og bilateral NALT ablasjon, ufullstendig ablasjon, eller intakt NALT. Fordi ikke alle operasjoner vil resultere i fullstendig tap av NALT, dyr med rester eller intakt NALT kan brukes som interne kontroller. En annen potensiell utfallet er at ganen ikke fullstendig helbrede, og etterlot en åpning forbinder nasal og munnhulen. Ufullstendighelbredelse av ganen vil resultere i lav vekt og manglende trives, og disse personene bør fjernes fra studiene. Undersøke vaksine svar først med mus modell vil tjene til å etablere en rolle for NALT i den tiltenkte undersøkelsen utfallet (antistoffrespons, overlevelse, etc.). Kirurgisk fjerning av NALT forenkler fastsettelse av nasale bidrag til lokal og systemisk immunitet. Den kirurgiske tilnærming som beskrives her er den mest direkte metoden for å få en mus modell blottet for NALT. Velg knock-out mus modeller har blitt rapportert å mangle NALT, men disse dyrene også er mangelfull i cytokiner eller chemokines avgjørende for utviklingen av andre sekundære lymfoide vev, og kan huse flere defekter 12,13. Videre ble de metodene som er beskrevet her er utviklet for å undersøke flere aspekter av immunreaksjoner opprinnelse innenfor nesegangene. Våre eksperimentelle resultatene er basert på studier med hele øvre palate fra musen for vevskultur, selv om det er mulig at deler kan brukes. Endelig er den kultiverte NALT modellen nyttig for å utføre eksperimenter helt i vevskultur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Rustfrie Sterile Surgical Blades, nr. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Knivskaftet, nr. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48-vel Cell Culture Plates </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serum, Heat Inaktivert </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Endelig Kons: 10% av volumet i kultur media </td></tr><tr><td> Streptomycin Sulfate </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Endelig Kons: 100 mikrogram / ml </td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Endelig Kons: 100 UI / ml </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ml </td><td> Endelig Kons: 50 mikrogram / ml </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Endelig Kons: 1 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Endelig Kons: 10 mm </td></tr><tr><td> Eppendorf Mikrosentrifugerør </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel Cherry Flavored Mouse våtfôr </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-SKUFF </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> En dråpe 1,5 mg / ml mikstur </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Endelig Conc: 6,06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Endelig Kons: 0,061 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Endelig Kons: 0.667 mg / ml </td></tr><tr><td> Puralube Vet salve </td><td> Pharmaderm Animal Health </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% natriumklorid injeksjonsvæske USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Termisk elektrokirurgi Unit </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Replacement Tip, Straight Fin Loop </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Kirurgiske Saks </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% nøytralt bufret Formalin </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Maursyre </td><td> Fisher </td><td> A119P-4 </td><td> Bland 426 ml maursyre inn i 1047 ml vann fra springen, og deretter legge 45 mL Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Fisher </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rotasjonsmikrotom </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Mayer Hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill No.1 Hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Separator </td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbufret Saline </td><td></td><td></td><td> 100 mm NaH 2 4 PO, 140 mM NaCl, 7,4 pH </td></tr><tr><td> Proteasehemmer Cocktail, EDTA-fri </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

De nasofaryngeal-tilknyttede lymforetikulære vev (NALT) funnet hos mennesker, gnagere og andre pattedyr, bidra til immunitet i nesen bihulene 1-3. Den NALT er to parallelle klokkeformede strukturer som ligger i nesegangene over den harde ganen, og er vanligvis ansett for å være sekundære komponenter av mucosal-assosiert lymfoid system 4-6. Ligger innenfor NALT er diskrete avdelinger av B-og T-lymfocytter ispedd antigen-presentasjon dendrittiske celler 4,7,8. Disse cellene er omgitt av en epitelial celle laget mellomlag med M-celler som er ansvarlig for antigen henting fra slimhinnene flater av luftrørene 9,10. Naive lymfocytter sirkulerer gjennom NALT er klar til å svare på første møter med respiratoriske patogener 7. Mens NALT forsvinne hos mennesker i en alder av to år, Waldeyer ring og tilsvarende strukturert lymfatiske organer fortsette å vedvare throughout liv 6. I motsetning til mennesker, mus beholde NALT gjennom hele livet, og dermed gi en praktisk dyremodell for studier av immunreaksjoner opprinnelse innenfor nasal bihulene 11. Kulturer av encellede suspensjoner av NALT er ikke praktisk på grunn av lav avkastning av mononukleære celler. Imidlertid kan NALT biologi bli undersøkt av ex vivo dyrking av intakt orgel, og denne metoden har den ekstra fordelen av å opprettholde den naturlige vevet struktur. For in vivo studier, genetiske knockout modeller presentere defekter begrenset til NALT er for øyeblikket ikke tilgjengelig på grunn av en dårlig forståelse av den utviklingsmessige veien. For eksempel, mens lymfotoksin-alfa knockout mus har atrophied NALT, blir Peyer sine lapper, perifere lymfeknuter, follikulære dendrittiske celler og andre lymfevev også endret i disse genetisk manipulert mus 12,13. Som et alternativ til genet knockout mus, kirurgisk ablasjon permanently eliminerer NALT fra nasal passasje uten å påvirke andre vev. Den resulterende mus modell har blitt brukt til å etablere relasjoner mellom NALT og immunresponser mot vaksiner 1,3. Serial samling av serum, spytt, nasale vasker og vaginale sekreter er nødvendig for å etablere grunnlag av verten svar til vaksinasjon, mens immunreaksjoner stammer direkte fra NALT kan bekreftes ved vevskultur. Følgende prosedyrer skissere operasjoner, vev kultur og prøvetaking er nødvendig for å undersøke lokale og systemiske humorale immunresponser til intranasal (IN) vaksinasjon.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Metoder for å undersøke bidrag fra nasofaryngeal-tilknyttede lymforetikulære vev (NALT) til nasale og systemisk immunresponser av mus til intranasal vaksiner er beskrevet. Vi viser en kirurgisk prosedyre for å etablere en NALT-avhengig mus modell og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kulturer av ekstrahert NALT.

Undersøke rolle Nasofaryngeal-assosiert lymforetikulært vev (NALT) i Mus Responses til Vaksiner

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisering av Rykninger motilitet og karakterisering av rollen til<em&gt; PilG</em&gt; i<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsiktig overvåking av inflammatoriske responser

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Immunisering av voksen sebrafisk for prekliniske Screening av DNA-baserte vaksiner

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen til dendrittiske celler i graft-versus vertssykdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...