Name: examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Stöd kom från Becton Dickinson Technologies. Åsikter uttryckta i denna ansökan är de som av författarna och inte anspråk på att spegla officiella politik den amerikanska regeringen. Undersökningen genomfördes i enlighet med djurskyddslagen och andra federala lagar och andra författningar som rör djur och experiment med djur och följer principerna i Guide för vård och användning av försöksdjur, National Research Council, 1996. Anläggningen där denna forskning bedrivs är fullt ackrediterad av Föreningen för bedömning och ackreditering av försöksdjur Care International.

1. NALT Insamling och odling <ol><li> Euthanize möss med godkända lACUC vägledning. Undvik att använda inhalations bedövningsmedel som kan påverka NALT. Överför möss för en aseptisk arbetsyta eller biosäkerhet skåp. Ta bort den nedre käken av musen och rengör den övre gommen området med alkohol och jod våtservetter. </li><li> Använda en Nr 11 kirurgiskt blad i kirurgisk kniv handtaget för att noggrant kapas och skära ut den övre gommen genom att följa den inre konturen hos mus framtänder och kindtänder. </li><li> Dra försiktigt tillbaka gommen med pincett, är noga med att inte riva gommen. </li><li> Detta steg är nödvändigt för att minska föroreningen av kulturer och är utformad för behandling flera smaklökar. Ställe gom till individuella brunnar i den första kolumnen i en steril 48-brunnars platta i förväg fylld med 250 | il av komplett odlingsmedium (37 ° C) bestående av RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 100 ug / ml streptomycin, 100 Ul / ml penicillin, 50 | ig / ml gentamicinoch 1 | ig / ml fungizon / amfotericin. Media bör vara karbonat buffrade, om gom odlas i ett 5% CO2 / 95% fuktig luft inkubator (37 ° C), eller alternativt använda 10 mM HEPES, pH 7,4, för icke-CO 2 kultur. </li><li> Att tvätta gommar, använda pincetter för att flytta gom i varje successiv brunn i en rad, noggrant trycka plattan mellan tvättarna, tills gommen har genomgått en totalt åtta tvättar. </li><li> Överföra gom i en ny steril 48-brunnars platta innehållande 250 ^ il färskt komplett odlingsmedium (37 ° C) i brunnarna. </li><li> Placera plattorna innehållande de gom i en 37 ° C inkubator under odling under varaktigheten av studien. </li><li> Samlar in prover för analys genom att aseptiskt överföra 100 | il av medium från odlingsbrunnar i Eppendorf-rör var 24: e timme, ersätt med 100 | il färskt 37 ° C odlingsmedium. </li><li> Centrifugera odlingsmediet proverna vid 380 xg under 10 minuter, 4 ° C, för att pelletera skräp. </li><li> Överför supernatanten från den centrifugerade provet till färska Eppendorf-rör och lagra vid -20 ° C tills den ska analyseras. </li><li> Antigen-specifikt IgG, IgM och IgA eller utsöndrade cytokiner mäts i vävnads-odlingssupernatanter genom standardmetoder enzymkopplade immunabsorberande analys (ELISA). </li></ol> 2. Kirurgisk Ablation av NALT <ol><li> BALB / c-möss, 7 till 9 veckor gamla, är lämpliga ämnen, men andra stammar är också acceptabla. Ge gel-liknande våtfoder tre dagar före operation för att acklimatisera mus till mat och vatten ersättning som kommer att administreras efter operation. </li><li> Administrera en droppe Metacam smärtlindring medicinering (1,5 mg / ml eller 0,05 mg / droppe) i munhålan före operation. </li><li> Bedöva möss med godkända lACUC vägledning, till exempel med en ketamin, acepromazin och xylazin blandning (KAX) och tillämpa Puralube Vet Salva på ögonen för att förhindra torkning. Undvik att använda inhalations bedövningsmedel som kan påverka NALT. Ennesthesia kan bekräftas genom frånvaron av reflexen svar på en mild klämmande av tårna. </li><li> Administrera 1 ml saltlösning (0,9% natriumklorid för injektion USP) subkutant mellan skulderbladen med användning av en 22-28 gauge nål och spruta för att förhindra potentiell dehydratisering av mus efter kirurgi. Också administrera 0,1 ml Respiram subkutant mellan skulderbladen med en 22-28 gauge nål och spruta för att främja ett hälsosamt andningen under och efter operationen. </li><li> Åstadkomma termisk stöd till musen under alla efterföljande manipuleringar. </li><li> Placera bedövades musen i ryggläge, och använder två separata slingor av kirurgisk sutur runt de övre och nedre framtänderna att försiktigt bända öppen mynning, vilket exponerar den övre gommen. </li><li> Använda en Nr 11 kirurgiskt blad för att göra en incision approximativt 3 mm i längd ned mittlinjen av den övre gommen i stället för NALT. </li><li> Sätt en 0,5 mm microcurette i snittet och försiktigt skrapa i kanterna för attstöra NALT. </li><li> Bränna snittet för att stoppa blödning med en rak fin slinga på en termisk kauterisation enhet. </li><li> Fortsätt termisk stöd medan musen återhämtar till fullt medvetande och aktivitet. </li><li> Ge mus med koksaltlösning subkutant upp till tre gånger per dag, 1 ml per injektion mellan skulderbladen, för att förhindra uttorkning vid behov och orala smärtstillande gång om dagen i 3 dagar efter operationen. Bestäm uttorkning genom att utföra ett test huden tält för att kontrollera huden turgor. Ta tag i huden och pälsen mellan skulderbladen bladen så att det Tented upp. Om huden snabbt återgår till den normala, tidigare ståndpunkt, är pekaren inte dehydratiserad. Om huden förblir förhöjd och rör sig långsamt, är mus i ett tillstånd av dehydratisering och kräver saltlösning. Ge våtfoder i minst tre dagar efter operation för att ge tillräcklig tid för återhämtning. </li><li> Innan några experimentella procedurer, observera möss 8-10 dagar genom att spåra viktökning. Dålig vikt återvinningoftast indikerar ofullständig gommen healing, och dessa möss bör dras tillbaka från ytterligare studier. </li></ol> 3. Förberedelser NALT för histologi och bedöma framgång för NALT kirurgi <ol><li> Framgången med NALT kirurgi måste fastställas genom histologi såsom beskrivs nedan. Efter att ha avslutat alla experimentella studier, förbereda mus för kranial samlingar euthanizing med godkända lACUC vägledning. Undvik att använda inhalations bedövningsmedel som kan påverka NALT. </li><li> Ta tag i nacken på avlivas musen. Ta bort underkäken från resten av skallen genom att klippa genom kondylära processerna med en sax på båda sidor. </li><li> Starta vid nacken, ta bort hud och päls från skallen genom att sakta skala och skär mot den ventrala sidan av kraniet. </li><li> Försiktigt bort huden runt den nasala område och klipp huden bort från spetsen av nosen för att avlägsna fullständigt. </li><li> Lossa kraniet från kotorna witha klipp i saxen. </li><li> Sätt saxen i foramen magnum och skär halvvägs kraniet längs mittlinjen för att möjliggöra permeation av formalin i de mjuka vävnaderna under fixering. </li><li> Fixera kraniet i 10% neutral buffrad formalin (NBF) under 24 timmar vid rumstemperatur. </li><li> För att kalka, placera provet och separata kassett, inlindad i gasbinda för att förhindra att Rexyn från att röra benet, i flaska med myrsyra blandningen. Inkubera under 12 h vid rumstemperatur och sköljs sedan kontinuerligt under kranvatten under ca 20 minuter. </li><li> Trimma provet till septum och förbi ögat banor med ett rakblad. </li><li> Prov och kassett kan lagras på kort sikt i 10% NBF. </li><li> Placera provet på en vävnadsprocessor för natten bearbetning. Detta görs för att avlägsna vatten från provet som förberedelse för paraffininbäddning. </li><li> Ta bort bearbetas vävnad, bädda in en paraffin block med nosen ner, och låt det svalna. </li><li> Trim rgrundlig 15 um tvärsnitt av blocket med en automatiserad mikrotom, närmar den ungefärliga platsen för NALT, fortsätt sedan skära i 5 jim avsnitten för montering på objektglas i ett 44,3 ° C vattenbad. </li><li> Hematoxylin och eosin (H &amp; E) histologi färgning bör användas för att bedöma NALT ablation. </li></ol> 4. Insamling av biologiska prover från möss 4,1 Serum <ol><li> Försiktigt höja kroppstemperaturen med en värmelampa kommer att öka blodflödet. Samla upp blod genom hackning den laterala svansvenen med en kirurgisk kniv. Låt blodet droppa fritt in en Microtainer serum separator rör. </li><li> Försiktigt tryck på nick med absorberande material, såsom gasväv eller handduk, för att stoppa blodflödet. </li><li> Låt blodet att koagulera i Microtainers i 30 minuter och centrifugera därefter mellan 6-15 x 1.000 g under minst 90 sekunder. </li><li> Överför separerade serum från Microtainer till ett rent Eppendorf rör förlagring vid -80 ° C. </li></ol> 4,2 Saliv <ol><li> Håll sövd musen vertikalt medan pipettera 20-30 pl steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) mellan kinden och tandköttet linje. Samla den utspädda saliven genom att rikta pipettspetsen mellan kinden och tandköttet. </li><li> Överföra det utspädda saliv till ett nytt rör innehållande 10 pl av 2x proteasinhibitor och lagra vid -20 ° C. </li></ol> 4.3 Nasal sekret <ol><li> Euthanize musen innan insamling nasala sekret, med godkänd lACUC vägledning. Undvik att använda inhalations bedövningsmedel som kan påverka NALT. </li><li> Håll musen vertikalt, försiktigt pipettera 30 il av steril PBS i ena näsborren och samla skölj från andra näsborren. </li><li> Överföra skölj till ett nytt rör innehållande 10 pl av 2x proteasinhibitor och lagra vid -20 ° C. </li></ol> 4.4 slidsekret <ol><li> För in spetsen på en mikropipett i öppningen av the vulva av avlivades mus, skölj slidan med 50 pl sterilt PBS och samla in all vätska genom mikropipett. </li><li> Överföra skölj till ett nytt rör innehållande 10 pl av 2x proteasinhibitor och lagra vid -20 ° C. </li></ol> 5. Antigen-specifika antikroppar eller cytokiner i de uppsamlade proverna kan mätas genom ELISA eller annan kvantitativ metod. 6. Representativa resultat Figur 1 ger en allmän schema över stegen med behandling av NALT innehållande vävnad för ex vivo analys. I figur 2 (A, B), är storleken på gommen visas, såväl som placeringen av snittet under ablation kirurgi (A), såsom indikeras av den streckade linjen. Placeringen av NALT indikeras med pilar i premolar området på ett skars hematoxylin-färgad gommen i fig. 2 (C) visar de parallella vävnader. Figur 3presenterar stegen av NALT störningar kirurgi, som visar exponering av den övre gommen för tillträde till NALT (A, B), ablation (C), och slutlig kauterisation av snittet (D). En typisk H &amp; E tvärsnitt av den nasala sinus område som omger NALT före operation visas i figur 3E, medan en bild av NALT störningar av microcurette direkt efter operation visas i Fig. 3F. Ger tillräckligt med tid för återhämtning från kirurgi, bör snitten stängas och näshålan saknar NALT (Figur 3G). Typiska experimentella resultat erhållna med användning av dessa tekniker är visade i figur 4, jämför supernatanter vävnadsodlingsplattor och biologiska prover från en studie av en stafylokock-subenhet-vaccin (STEBVax). Möss administrerades STEBVax genom intranasal (IN) eller intraperitoneal (IP) vägar. Vaccinet formulerat med ett adjuvans som aktiverar Toll-like receptor 4 väg 3,1<html> 4 och kontroller ges endast saltlösning eller vaccin utan adjuvans. Odlade NALT från experimentella grupper utsöndras antigenspecifika immunoglobuliner i medium som var mätbar med ELISA. I detta exempel (figur 4A), tyder resultaten på att de största mängderna av IgA frisattes genom NALT erhölls från möss som vaccinerats med IN ett subenhetsvaccin i kombination med adjuvans. Biologiska prover (t.ex. serum, saliv, nasala sekretioner, vaginalsekret) förvärvades från kontroll-eller NALT-fria möss kan användas för att profilera den in vivo immunsvar mot nasala antigener för jämförelse med resultaten för vävnadsodling. I Figur 4B, IgA-och IgG-svar I vaccination var signifikant minskade utan funktionell NALT. Nivåer av antigen-specifik IgA i allmänhet var högre än IgG vid mukosala sekret (saliv, nasala tvättar) hos vaccinerade möss. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Schematisk i NALT insamling och ex vivo odling. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figur 2. Visualisering av musen gommen indikerar positionen för NALT och kirurgi snitt. Storlek och placering av övre gommen med kirurgi snittet betecknas med streckad linje (A), övre gommen exciderad (B) eller betsad i hematoxylin (C) för att visa den parallella NALT i premolar området gommen (färgade mörkt lila på främre sidan av gommen ). NALT anges med pilar. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figur 3. Surgical NALT störningar. Viktiga steg i NALT störningar kirurgi: ryggläge syn på musen övre gommen före operation (A), mittlinjesnitt görs på övre gommen för att komma åt NALT (B); microcurette sond in genom medellinjesnitt att störa NALT strukturtegrity (C), kauterisation av snitt vid ingåendet av kirurgi (D). Mikroskopiska bilder av näshålan, H &amp; E färgade, före operation (E), omedelbart efter kirurgi (F), och ett framgångsrikt läkt, NALT utan mus (G). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figur 4. Vaccine-specifika antikroppar från odlade NALT, saliv och nasala sekretioner som samlats in från vaccinerade möss. NALT-fria eller normala kontrollmöss vaccinerades IN eller IP med STEBVax, och biologiska prover samlades in. Antikroppsnivåer av trefaldiga prover mättes med ELISA. (A) NALT togs bort från kontrollmöss (inte kirurgiskt manipuleras) och odlas för att undersöka antikroppssvar. Vaccinet-specifik IgA-svar i odling under hos vaccinerade möss var statistiskt signifikant skilt från kontrollvärdet (Students t-test, p ≤ 0,01, jämfört med ingen adjuvant eller inget vaccin). (B) NALT störningar reduceras avsevärt specifikt antikroppssvaratt vid vaccinering. Det var signifikanta skillnader mellan specifika antikroppsnivåer av NALT-och NALT + grupper (ingen operation eller kontroll kirurgi) för alla jämförelser utom saliv IgG resultat (Students t-test, p ≤ 0,05).

<ol>
	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li><li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li><li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT+(nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue)+in+the+rabbit.">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li><li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT):+frequency+and+localization+in+young+children.">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li><li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue:+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+naïve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site.">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li><li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses.">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li><li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue:+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus.">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li><li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium.">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li><li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lymphoid+tissue,+intranasal+immunization,+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system.">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li><li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT)+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+(LT+alpha)+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma,+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent.">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li><li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXC+chemokine+ligand+13,+CC+chemokine+ligand+(CCL)+19,+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li><li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome.">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Vi har presenterat kollektiva metoder för att utveckla en djurmodell, att få biologiska prover och analyser för undersökning NALT-associerade immunsvar 1-4. Det finns ytterligare faktorer att tänka på under utförandet av dessa metoder. Standard sterila tekniker för kirurgi och vävnadsodling bör följas. En kombination av antibakteriella och svampdödande medel som används vid isolering och odling, samt behålla steriliserade instrument, arbetsområdet och desinfekteras gommar kommer att minska risken för kontaminering. Saliv, nasala tvättar och liknande slemhinnor prover sekretion bör inspekteras för eventuell kontaminering med blod, som serumantikroppar i allmänhet finns i högre koncentrationer. Vidare bör slemhinnesekret endast något utspädd för analys på grund av lägre koncentrationer av antikroppar är närvarande i dessa prover jämfördes med serum. Möss ska hållas varm direkt efter operation för att preventilera potentiella anestesi-inducerad hypotermi. Alternativa vila möss på sina sidor under post-operation återhämtning för att minimera oregelbundna andning. Det kirurgiska ingreppet är mer effektiv med tre personer som arbetar tillsammans för att slutföra dessa uppgifter: en utföra operationen, en för att hjälpa till att hålla munnen öppen och en att ge postoperativ omvårdnad som mössen återhämta sig från anestesi. Det är nödvändigt att använda H &amp; E färgning av kraniala tvärsnitt vid slutet av alla experimentella procedurer eller studier för att verifiera framgång kirurgi för varje mus. Möjliga kirurgi resultat är: kompletta och bilateral NALT ablation, ofullständig ablation eller intakt NALT. Eftersom inte alla operationer kommer att resultera i fullständig förlust av NALT, djur med kvarstående eller intakt NALT kan användas som intern kontroll. En annan potentiell resultatet är att gommen inte helt läka, lämnar en öppning som förbinder nasala och orala kaviteter. Ofullständigläkning av gommen kommer att resultera i låg vikt och underlåtenhet att frodas, och dessa personer bör tas bort från studier. Undersöka vaccin svar först med musen modellen användas för att fastställa en roll för NALT i avsedda studien utfallet (antikroppssvar, överlevnad, etc.). Kirurgiskt avlägsnande av NALT underlättar bestämningen av nasala bidrag till lokal och systemisk immunitet. Den kirurgiska metod som beskrivs här är den mest direkta metoden för att erhålla en musmodell som saknar NALT. Välj knock-out musmodeller har rapporterats sakna NALT, men dessa djur också har brist på cytokiner eller kemokiner är väsentliga för utvecklingen av andra sekundära lymfoida vävnader och kan hysa ytterligare fel 12,13. Vidare var de metoder som beskrivs här utvecklats för att undersöka flera aspekter av immunsvar har sitt ursprung i de näsgångarna. Våra experimentella resultat är baserade på studier med användning av hela den övre Palate från mus för vävnadsodling, fastän det är möjligt att sektionerna kan användas. Slutligen är det odlade NALT modell användbar för att utföra experimenten helt i vävnadskultur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Rostfritt stål sterila kirurgiska Blades, nr 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Kniv Handtag, nr 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48-brunnars Cellodlingsplattorna </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum, värmeinaktiverat </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Slutlig konc: 10 volym-% i odlingsmedia </td></tr><tr><td> Streptomycinsulfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Slutlig konc: 100 | ig / ml </td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Slutlig konc: 100 Ul / ml </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10 ml </td><td> Slutlig konc: 50 | ig / ml </td></tr><tr><td> Fungizon </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Slutlig konc: 1 | ig / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Slutlig konc: 10 mM </td></tr><tr><td> Eppendorf mikrocentrifugrör </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel körsbärssmak Mouse våtfoder </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-TRAY </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> En droppe av 1,5 mg / ml oral suspension </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Slutlig Conc: 6,06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acepromazin </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Final Konc: 0,061 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Final Konc: 0,667 mg / ml </td></tr><tr><td> Puralube Vet Salva </td><td> Pharmaderm Animal Health </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% natriumklorid för injektion USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Termisk kauterisation Enhet </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Replacement Tips, Straight Fine Loop </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Kirurgsax </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% neutral buffrad formalin </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Myrsyra </td><td> Fisher </td><td> A119P-4 </td><td> Blanda 426 ml myrsyra i 1047 ml kranvatten, tillsätt sedan 45 ml Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Fisher </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Roterande mikrotom </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Mayers hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill nr 1 Hematoxylin </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Separator </td><td> BD Medical </td><td> 365.956 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Proteasinhibitorcocktail, EDTA-fri </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78.415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

Den nasofaryngeala-associerade lymforetikulära vävnaderna (NALT) som finns i människor, gnagare och andra däggdjur, bidra till immunitet i bihålorna 1-3. Den NALT är två parallella klockformade strukturer som finns i näsgångarna ovanför hårda gommen, och brukar anses vara sekundära komponenter i slemhinnan-associerade lymfoida systemet 4-6. Belägen inuti NALT är diskreta utrymmen av B-och T-lymfocyter uppblandade med antigen-presenterande dendritiska celler 4,7,8. Dessa celler är omgivna av en epitelcellskiktet inskjutna i M-celler som är ansvariga för antigenåtervinning från de mukosala ytorna av luftpassagerna 9,10. Naiva lymfocyter cirkulerar genom NALT är redo att svara på de första möten med respiratoriska patogener 7. Medan NALT försvinner hos människor vid en ålder av två år, Waldeyer ring och liknande strukturerade lymfatiska organ fortsätter att framhärda throughout liv 6. I motsats till människor möss behåller NALT hela livet, vilket ger en bekväm djurmodell för att studera immunsvar ursprung inom bihålorna 11. Kulturer av encelliga suspensioner av NALT är inte praktiska på grund av låga utbyten av mononukleära celler. Emellertid kan NALT biologi undersökas genom ex vivo-odling av den intakta organ, och detta förfarande har den ytterligare fördelen av att bibehålla den naturliga vävnaden strukturen. För in vivo-studier, genetiska knockout modeller presenterar fel begränsas till NALT för närvarande inte tillgängliga på grund av en dålig förståelse för den utvecklande vägen. Till exempel, medan lymfotoxin-a knockout möss har förtvinat NALT är de Peyers plack, perifera lymfkörtlar och follikulära dendritiska celler och andra lymfoida vävnader också ändras i dessa genetiskt manipulerade möss 12,13. Som ett alternativ till möss gen knockout, kirurgisk ablation permanently eliminerar NALT från den nasala passagen utan att påverka andra vävnader. Den resulterande musmodell har använts för att fastställa förhållandet mellan NALT och immunsvar på vacciner 1,3. Seriell samling av serum, saliv, nasala tvättar och vaginala sekret är nödvändig för att fastställa grunden för värd svar på vaccination, medan immunsvar ursprung direkt från NALT kan bekräftas genom vävnadsodling. Följande procedurer beskriva de operationer, vävnadsodling och provtagning som behövs för att undersöka lokala och systemiska humorala immunsvar mot intranasal (IN) vaccination.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Metoder för att undersöka bidragen från nasofaryngealt-associerade lymforetikulära vävnaderna (NALT) till näsan och systemisk immunsvar hos möss mot intranasala vacciner beskrivs. Vi visar ett kirurgiskt förfarande för att fastställa en NALT-beroende musmodell och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kulturer av extraherat NALT.

Undersöka roll Nasofaryngeal-associerad lymfretikulärvävnad (NALT) i Mus Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Att mäta bakteriehalten och immunsvar hos möss som blivit infekterade med Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisering av Twitching rörlighet och karakterisering av roll<em&gt; PilG</em&gt; i<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model för<em&gt; In vivo</em&gt; Långvarig övervakning av inflammatoriska reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overuttryck och rening av människa<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferas i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

Immunisering av vuxen zebrafiskar för prekliniska Screening av DNA-baserad vacciner

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Bone Marrow Transplantation Plattform för att undersöka rollen av dendritiska celler i Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...