Name: detection of bacteria using fluorogenic dnazymes
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00
Duration: 13 min 20 s
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この仕事のための資金は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC）とSentinel生理活性紙ネットワークによって提供されました。

<ol>
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Chem. 85, 261-273 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates.">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design.">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224 (2007).</li><li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing.">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li><li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5.">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li><li>Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+assembly+of+nanospecies+on+repetitive+DNA+sequences+generated+on+gold+nanoparticles+by+rolling+circle+amplification.">Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification.</a> Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).</li><li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications.">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li><li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe.">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

今日一般的な細菌の検出方法のほとんどは、低速（古典的な微生物）または技術的に（抗体、PCR）を求めています。そこで、検出ツールの次の世代は、スピードとシンプルさに向かって応えるべきだと思います。この目的のために、我々は、RNA切断し、蛍光シグナルの生成を介して細菌の存在を報告するためにシンプルなアッセイを開発するために使用することができ、蛍光シグナルDNAザイムを作成しました。注目のDNAザイムプローブ、RFD-EC1は、E.の成長時に生成CEMによって活性化される培養培地中の大腸菌 。提案手法は、検出の対象として細菌の粗細胞混合物を使用して、面倒なターゲットの抽出と増幅のステップをバイパスしているので、それは細菌検出のためのアッセイの非常に単純な、 &quot;ミックス·アンド·読む&quot;のタイプを設定するために使用することができます。私たちのDNAザイムの使用は、蛍光ベースの検出方法に限定されません。同じDNAザイムシステムアッセイcを使用して、例えば、比色検出有機色素と一緒にローリングサークル増幅を利用し、以前に報告された方法を用いて設計することができます。32我々は、より大きな運用の簡素化と新たな細菌のバイオセンサーを生成するための魅力的な道のような細菌を検出するためのDNAzymesの使用を予見する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号またはモデル </td></tr><tr><td>寒天</td><td> BioShopカナダ</td><td> AGR003 </td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム（APS） </td><td> BioShopカナダ</td><td> AMP001 </td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビスアクリルアミド（40％、29:1） </td><td> BioShopカナダ</td><td> ACR004 </td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td> BioShopカナダ</td><td> BOR001 </td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EMサイエンス</td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td>塩酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshopカナダ</td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> LBブロス</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2を </td><td> EMD化学品</td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> BioShopカナダ</td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> EMDケミカルズ</td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> EMDケミカルズ</td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShopカナダ</td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShopカナダ</td><td> TEM001 </td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td> BioShopカナダ</td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P9416 </td></tr><tr><td>尿素</td><td> BioShopカナダ</td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> X4126 </td></tr><tr><td> DNAコンセントレータ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SavantのDNA Speed​​Vac 120 </td></tr><tr><td>マイレクスフィルタユニット</td><td>ミリポア</td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td>ゲルローディングのヒント</tD&gt; <td> Diamed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> ImageQuantソフトウェア</td><td>分子動力学</td><td>バージョン5.0 </td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリークラークプロフェッショナル</td><td> 34705 </td></tr><tr><td>ミニボルテックス</td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td> Pechineyプラスチック包装</td><td> PM996 </td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettorプラス（ピペットガン） </td><td>コー​​ニング</td><td> 07764714 </td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>バリアン社</td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td>シェーカー/インキュベーター</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>クラシックシリーズC24 </td></tr><tr><td>台風スキャナ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 9200可変モード</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>ベックマン·コールター</td><td>アレグラX22-R </td></tr><tr><td> UV分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td>蛍光分光光度計</td><td>バリアン社</td><td>ケアリーのEclipse </td></tr></tbody></table>

detection of bacteria using fluorogenic dnazymes

発生はそれぞれ毎年死亡と入院の何百万人と同様に巨大な経済的損失のために食品を媒介と院内感染病原体のアカウントにリンクされています。進行中の流行の場所の影響を正確に早い段階で犯人の病原体を識別することができる分析法のためにますます需要のような流行と最小化の防止。高い特異性（興味のある唯一の細菌を検出）、高感度（低として検出することができる：病原体を検出するための効果的な方法の大きな配列があるが、それらのどれも理想的な検出方法のために具現すべて次の5つの最初の要件を満たすことはできません単一のライブ細菌細胞など）を、短時間-結果に（数分から数時間）、偉大な運用の簡素化（長いサンプリング手順や特殊な装置の使用の必要はありません）、および費用対効果。例えば、古典的な微生物学的方法は非常に特異的であるが、長い時間（DAを必要とする週間YS）が1 PCRおよび抗体ベースの技術は短い待機時間（数時間から数日）を提供しています。決定的な結果を取得するために、彼らは高価な試薬および/ ​​または洗練された装置の使用。結果2-4を必要とする、まだある前述の要件の1つまたは複数の特性の改善を提供する革新的な細菌の検出方法を開発に向けた科学研究のための大きな需要。当研究室では、細菌の検出を含むバイオセンシングアプリケーションのための分子プローブの新規クラスとしてDNAzymesの可能性を調べるに興味がある5。 DNAzymes（またdeoxyribozymesまたはDNA酵素として知られている）は人工の化学反応を触媒する機能を備えた一本鎖DNA分子を6-8、これらの分子は、多くの10とを含む広大なランダムシーケンスDNAプール（から単離することができる16個の配列）o &quot;はin vitroでの選択で &quot;として知られるプロセスによってR &quot;SELEX&quot;（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）。9月16日これらの特別なDNA分子は、広くバイオセンシングアプリケーションのための分子ツールとして近年検討されている6-8。 我々の研究室ではRNA-切断蛍光DNAzymes（RFDs、図1）を単離するためのインビトロでの選択の手順で確立したと分析のツールとしてRFDsの使用を検討した17から29 RFDsは、単一のリボヌクレオチドでDNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。蛍光体（F）およびクエンチャー（Q）によって挟まれているジャンクショ​​ン（R）。 FとQの近くには未開基板最小限の蛍光をレンダリングします。しかし、切断イベントは、蛍光強度の顕著な増加を伴っているFとQの分離につながる。 最近では、我々は、細菌を検出するためのRFDsを単離する方法を開発しました。5これらの特別なRFDsは&quot;に分離された粗混合物を使用すると、浄化の退屈なプロセスを回避します。自分の環境で、またはそれらが培養されているメディアの中の細菌の特定のタイプ（ 図1）によって残された原油の細胞外液（CEM）の存在下で、 &quot;点灯し、バイオセンサーの開発（完了するまで数ヶ月または数年かかる可能性がある）の対象となる微生物から適切なターゲットを識別します。外のターゲットを使用すると、細胞内のターゲットを取得する手順については、必要はありませんので、検定の手順はシンプルであることを意味します。 のみE.によって生成されたCEMの存在下で、上記のアプローチを使用して、我々は（ 図2A。FS1）は、その基板を切断するRFDを導出した大腸菌 （CEM-EC）。5このE. RFD-EC1（ 図2A）という名前の大腸菌検出RFDは、厳密にCEM-ECへの応答が他の細菌のホスト（ 図3）からのCEMに応答しなくなることが判明した。 ここでは、presaの複数形NT E.を設定するための重要な実験手順RFD-EC1と代表的な結果を用いて大腸菌の検出アッセイ。

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Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを &quot;ミックス·アンド·読む&quot;を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、 &quot;RFD-EC1&quot;を表すモデルの細菌の検出のために採用されている重要な実験手順を説明します。<em&gt;大腸菌（Escherichia coli）</em&gt;。

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

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Research

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