Name: isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol
Uploaded: 2012-05-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol at JoVE.com

Nous remercions Jonna Ellis pour son assistance éditoriale. Le projet décrit a été soutenue par R01MH079751 Nombre Prix (PI: F. Peruzzi) de l&#39;Institut national de la santé mentale. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national de santé mentale ou de la National Institutes of Health.

1. Poly-D-Lysine (PDL): Préparation <ol><li> Ajouter 5 ml de solution stérile ddH 2 O à 5 mg de PDL pour obtenir une solution stock de 1 mg / ml. </li><li> Mélanger la solution stock de pipetage à plusieurs reprises. </li><li> Utiliser immédiatement ou conserver Poly-D-Lysine solution à 2-8 ° C. </li></ol> 2. Poly-D-Lysine (PDL): revêtement en plastique Vaisselle Culture Cellulaire <ol><li> Diluer la solution mère PDL stérile O ddH 2 à la concentration finale...

<ol>
	<li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage.">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons.">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons.">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li><li>Eletto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SNAP25+expression+by+HIV-1+Tat+involves+the+activity+of+mir-128a.">Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a.</a> J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).</li><li>Gualco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-IR-dependent+expression+of+Survivin+is+required+for+T-antigen-mediated+protection+from+apoptosis+and+proliferation+of+neural+progenitors.">IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors.</a> Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain.">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li><li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+in+the+hippocampus:+critical+role+for+glial+cells.">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li></ol>

La méthode de la dissection et la culture de neurones d&#39;hippocampe de rat et corticale décrite ici permet d&#39;effectuer des expériences en utilisant presque purs des cultures de neurones cultivés dans un milieu chimiquement défini (Figure 3). Bien que les protocoles pour les neurones en culture presque purs dans des milieux sans sérum ont été décrits précédemment 2,3,4, il ya des changements importants réalisés dans notre méthode. Différent de protocoles traditionnels (c....

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 98% </td></tr><tr><td> B27 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0,5 mM </td></tr></tbody></table> Tableau I. Neurobasal/B27 milieu complet. <table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 16 mM </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 22 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0,22 mM </td></tr><tr><td> La gentamicine </td><td> 50 pg / ml </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / ml </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Osmolarité </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> Tableau II. Milieu de dissection. <table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Volume (pl) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 milieu complet </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Bleu de Trypan Stain 0,4% </td><td> 250 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> Tableau III. 50x comptage solution. <table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Cat. nombre </td></tr><tr><td> Hibernate E </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Sulfate de gentamicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> Glutamax 200 mM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE express w / o rouge de phénol </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> Cytosine-β-D-arabinofuranoside chlorhydrate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminine 1 mg / ml </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Bleu de Trypan Stain 0,4% </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; Tableau IV. Des réactifs spécifiques. <table border="1"><tbody><tr><td> Équipement </td><td> Entreprise </td><td> Cat. nombre </td></tr><tr><td> Microscope stéréo </td><td> Olympe </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> Grande pince </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> À pointe fine pince </td><td> Moria </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> Micro à pointe fine pince </td><td> Moria </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> Tranchantes comme un rasoir ciseaux </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> Micro Ciseaux à dissection </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> Micro dissection Ciseaux courbes </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> Verre 2-chambre diapositives </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> Boîtes de 60 mm </td&gt; <td> BD Falcon </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> Boîtes de 100 mm </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> Tubes de 15 ml </td><td> BD Falcon </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1,5 ml cryo-tube de flacon </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> Tableau V. Equipements spécifiques.

isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol

Nous décrivons une méthode rapide de dissocier et de la culture neurones de l&#39;hippocampe ou corticale à partir d&#39;embryons de rat E15-17. La procédure peut être appliquée avec succès à l&#39;isolement de la souris et l&#39;homme neurones primaires et les progéniteurs neuronaux. Neurones dissociés sont maintenues dans un milieu sans sérum jusqu&#39;à plusieurs semaines. Ces cultures peuvent être utilisés pour nucléofection, immunocytochimie, la préparation des acides nucléiques, ainsi que l&#39;électrophysiologie. Les seniors cultures neuronales peuvent également être transfectées avec un taux d&#39;efficacité de bon par transduction lentivirale et, de manière moins efficace, avec le phosphate de calcium ou à base de lipides des méthodes telles que la lipofectamine.

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Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Nous décrivons une méthode rapide d&#39;isoler et de la culture neurones de l&#39;hippocampe et du cortex à partir d&#39;embryons de rongeurs. Ce protocole nous permet d&#39;effectuer des expériences dans lesquelles presque purs des cultures de neurones sont nécessaires.

Isolement et culture de cellules embryonnaires de rat neurones: un protocole rapide

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

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