Name: isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol
Uploaded: 2012-05-24T12:00:00
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Wir bedanken uns bei Jonna Ellis für die redaktionelle Unterstützung. Vom National Institute of Mental Health: Das Projekt beschrieben wurde von Verleihungsnummer R01MH079751 (F. Peruzzi PI) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Mental Health oder des National Institutes of Health.

1. Poly-D-Lysin (PDL): Herstellung <ol><li> 5 ml sterilem ddH 2 O bis 5 mg PDL um eine Stammlösung von 1 mg / ml zu erhalten. </li><li> Mischen Sie Stammlösung durch mehrmaliges Pipettieren. </li><li> Sofort verwenden oder speichern Poly-D-Lysin-Lösung bei 2-8 ° C. </li></ol> 2. Poly-D-Lysin (PDL): Beschichtung Zellkulturschalen <ol><li> Verdünnen Sie die PDL-Stammlösung mit sterilem ddH 2 O auf die Endkonzentration von 10 ug / ml. </li><li> Pipette genug Lösung i...

<ol>
	<li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage.">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons.">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons.">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li><li>Eletto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SNAP25+expression+by+HIV-1+Tat+involves+the+activity+of+mir-128a.">Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a.</a> J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).</li><li>Gualco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-IR-dependent+expression+of+Survivin+is+required+for+T-antigen-mediated+protection+from+apoptosis+and+proliferation+of+neural+progenitors.">IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors.</a> Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain.">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li><li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+in+the+hippocampus:+critical+role+for+glial+cells.">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li></ol>

Die Methode der Präparation und Kultur von Ratten-Hippocampus und kortikalen Neuronen hier beschriebenen ermöglicht die Durchführung von Experimenten unter Verwendung nahezu reinen neuronalen Kulturen in einem chemisch definierten Medium (Abbildung 3) gewachsen. Obwohl Protokolle für die Kultivierung nahezu reinem Neuronen in serumfreiem Medium wurden zuvor 2,3,4 beschrieben, gibt es wesentliche Änderungen in unserer Methode. Anders als bei traditionellen Protokollen (zB Banker et al.) <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 98% </td></tr><tr><td> B27 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle I Neurobasal/B27 Vollmedium. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 16 mM </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 22 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0,22 mM </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 50 ug / ml </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / ml </td></tr><tr><td> pH-Wert </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolarität </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> Tabelle II. Dissection Medium. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volume (ul) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 Vollmedium </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Trypanblau Stain 0,4% </td><td> 250 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> Tabelle III. 50x Counting Lösung. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Cat. Anzahl </td></tr><tr><td> Hibernate E </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Gentamicinsulfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> 200 mM Glutamax </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE Express w / o Phenolrot </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> Cytosin-β-D-Hydrochlorid arabinofuranosid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin 1 mg / ml </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Trypanblau Stain 0,4% </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; Tabelle IV. Spezifische Reagenzien. <table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Cat. Anzahl </td></tr><tr><td> Stereo-Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> Große Zange </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> Fine-Pinzetten </td><td> Moria </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> Micro Fine-Pinzetten </td><td> Moria </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> Gestochen scharfe Schere </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> Micro Präparierschere </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> Micro Dissecting gebogenen Schere </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> Glas 2-Kammer-Objektträgern </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> 60 mm Platten </td&gt; <td> BD Falcon </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> 100 mm-Schalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Kryo-Röhrchen Fläschchen </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> Tabelle V. Ausstattung.

isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Dissoziation und Kultur oder kortikalen Neuronen des Hippocampus von E15-17 Rattenembryonen. Das Verfahren kann erfolgreich zur Isolierung von Maus und Mensch primären Neuronen und neuralen Vorläuferzellen angewendet werden. Dissoziierte Neuronen in serumfreiem Medium bis zu mehreren Wochen aufrechterhalten. Diese Kulturen können Nukleofektion, Immunzytochemie, Nukleinsäuren Herstellung sowie Elektrophysiologie verwendet werden. Ältere neuronalen Kulturen können auch mit einem guten Wirkungsgrad von lentiviralen Transduktion und, weniger effizient, mit Calciumphosphat oder Lipid-basierte Methoden wie Lipofectamin transfiziert werden.

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Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung und Kultur hippokampalen und kortikalen Neuronen aus Nagetier Embryonen. Dieses Protokoll erlaubt es uns, Experimente, in denen nahezu reinen neuronalen Kulturen sind erforderlich, durchzuführen.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...