Name: microfluidic mixers for studying protein folding
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда FIBR (NSF EF-0623664) и МКР (NSF DBI-0754570). Эта работа была частично поддержана финансирование от Национального научного фонда грант FIBR 0623664, находящихся в ведении Центра биофотоники NSF научно-технический центр, управляемый Университета Калифорнии, Дэвис, под соглашением о сотрудничестве PHY 0120999. Исследование Лиза Лапидус, доктор философии поддерживается частично Карьера премии в Научно-интерфейс из Фонда Burroughs Welcome.

<ol>
	<li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding.">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li><li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding.">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li><li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+microfluidic+mixer+for+studying+protein+folding+kinetics.">Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics.</a> Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).</li><li>Yao, S., Bakajin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+Mixing+Time+and+Mixing+Uniformity+in+Devices+Designed+for+Studies+of+Protein+Folding+Kinetics.">Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics.</a> Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).</li><li>Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Hydrophobic+Collapse+and+Early+Folding+Steps+Observed+in+a+Microfluidic+Mixer.">Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).</li><li>Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchannel+solution+mixer+for+studying+microsecond+protein+folding+reactions.">A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions.</a> Review of Scientific Instruments. 76, (2005).</li><li>Chan, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing.">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li><li>Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous-flow+capillary+mixing+method+to+monitor+reactions+on+the+microsecond+time+scale.">A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale.</a> Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).</li><li>Pollack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compactness+of+the+denatured+state+of+a+fast-folding+protein+measured+by+submillisecond+small-angle+x-ray+scattering.">Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing.">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li><li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip:+Mixing+nanoliters+in+microseconds.">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li><li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer.">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li><li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L.">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li><li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale.">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li><li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness.">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li><li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain.">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Быстрое перемешивание было одной из целей развития в области сворачивания белка в течение многих лет, потому что уже давно признано, что молекулярные процессы биомолекул происходит на временных масштабах от пикосекунд до нескольких секунд. Обычные остановил поток смесители имеют мертвый время 1-5 мс который в основном ограничивается турбулентность. Турбулентных смесителей непрерывного потока с перемешивания 30-300 мкс были разработаны в течение последних 15 лет небольшое количество групп, но как правило, требуют больших расходов для достижения этих перемешивания и, следовательно, использовать много образцов 6-8. Этот протокол описывает использование микрофлюидных смешивания чипов для достижения быстрого разведения в режиме ламинарного потока. Есть несколько преимуществ в работе в этом режиме, но основной из них является возможность моделировать весь процесс смешивания с высокой точностью, которая позволяет изменять смешения ответ. T-смесители, разработанные другими группами с простой геометриейetries показали, время перемешивания 100-200 мкс, что было в первую очередь ограничивается размером каналов 9-10. По масштабирования размера каналов до 10 мкм Knight сократить время смешивания до ~ 10 мкс 11. Яо и Bakajin показали, что небольшие изменения в геометрии может привести к значительному улучшению перемешивания 4. Тем не менее, эта работа показала, что ускорения перемешивания также может привести к медленной фазы, а также. Конструкция, используемая в этой работе 12-13 представляет собой компромисс между двумя лучшими проектами в работе 4, чтобы минимизировать медленный экспоненциальный спад в денатуранта концентрации, а также сделать функцию более воспроизводимые в DRIE травления. Там были некоторые разногласия в области сверхбыстрой смешивания по определению времени перемешивания. Важно понимать разницу между &quot;перемешивания&quot; и &quot;мертвое время&quot;. Мертвое время определяется в турбулентном смесителе, как время, за которое ИЗМЕРЕНИЯт не может быть и на самом деле может быть значительно больше, чем фактическое время перемешивания. Это, как правило, определяется путем измерения несколько псевдо-первого порядка бимолекулярной реакции (такие как тушение флуоресценции триптофана N bromosuccinate) в различных концентрациях. Наблюдаемое экспоненциальный распад крепятся к сходятся в одном значении считать т = 0 с, а время между этой точкой и первым измеряется Дело в том, мертвое время. Для смесителей ламинарного потока, измерения могут быть сделаны во время процесса смешивания, поэтому нет мертвого времени, только время перемешивания. Время перемешивания просто время, чтобы объединить два решения, пока достаточное единообразие будет достигнута. Ранее мы уже определили время смешивания, чтобы быть 90/10 время, время для концентрации денатуранта сократится с 90% до 10% от несмешанных значение. Тем не менее, форма кривой смешения не является идеально симметричным хвост распадов с малым экспоненциальным компонента. Кроме того, сворачивание белков имееточень нелинейная зависимость от денатурации концентрации, так что складной часто может начинаться даже при денатурации только уменьшается в два раза. Поэтому мы совсем недавно определил время перемешивания, как раз для уменьшения денатуранта концентрации на 80%. Конечно, другие определения могут быть использованы в зависимости от требований эксперимента. Использование данного смесителя для изучения сворачивания белков последовательно показали удивительные результаты. Складные цитохрома с и apomyoglobin давно изучены, чтобы иметь несколько складных шаги и первые результаты с непрерывным потоком смесители показал распад происходит на ~ 100 мкс сроки 10,14-15. Наши измерения показали, этот микшер есть по меньшей мере, 2 шага на этом графике, очень быстро, скорее всего, неспецифические, коллапс (при измерении флуоресценции Trp спектральный сдвиг) в течение времени перемешивания смесителем следует медленнее фазы (как измеряется закалки от общего числа выбросов Trp), которые, скорее всего, ережде формирование нативной структуры 5. Мы также наблюдали 50 мкс процесса в B1 домен белка L, опрокидывание традиционной интерпретации, что этот белок является 2-государство папка 13. Преимущество такого быстрого микшер, что он может исследовать складывающиеся из самых складной белки, которые, как правило, только были измеримы наносекундной T-прыжок инструментов. T-прыжок обычно требует наблюдения складывания / развертывания релаксации вблизи температуры плавления белка и, следовательно, никогда не следует складывания всего населения. С помощью этого миксера мы рассмотрели складывания γ-репрессор (λ 6-86) с обеих выбросов Trp общего и спектрального сдвига так и не нашли доказательств того, что белок имеет никаких препятствий для складывающиеся под сильным складной условия, которые не были доступны для предыдущего T -переход измерений 12. Наконец, мы измерили складывания головной убор villin HP-35, один из тОн быстро папки еще измеряется и обнаружили, что скорость измеряется складной после смешивания составляет ~ 5 раз медленнее, чем измеряется T-прыжок на тех же условиях 16. Это означает, что складной кинетики зависит от начальных условий, опрокидывания основные предположения в этой области.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Я P4110 фоторезиста </td><td> Я электронных материалов </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K разработчика </td><td> Я электронных материалов </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Бейкер PRS 2000 фоторезиста стриптизерши </td><td> Материалы Avantor производительности </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond технологии </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 мкм пластины крышки </td><td> ДАТЧИК Prep услуги </td><td></td><td> Ø: 100 мм ± 0,5 мм Толщина: 0,5 мм ± 0,025 мм Стандартные допуски (если не указано) Обработка поверхности: SI: 4-8А; SII: 8-12A Квартиры: один первичный SEMI-STD; Один Scribe Чистые и полированные, с обеих сторон </td></tr><tr><td> 170 мкм пластины крышки </td><td> ДАТЧИК Prep услуги </td><td> 7980 2G Вафли </td><td> Ø: 100 мм ± 0,5 мм Толщина: 0,17 мм ± 0,025 мм Стандартные допуски (если не указано) Обработка поверхности: SI: 4-8А; SII: 8-12A Квартиры: один первичный SEMI-STD; Один Scribe Чистые и полированные, с обеих сторон </td></tr><tr><td> Глубоко реактивного ионного гравер для оксидов </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Аргонового лазера </td><td> Кембридж лазерной лаборатории </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> λ = 258 нм </td></tr><tr><td> Аргонового лазера </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> λ = 488 нм </td></tr><tr><td> Микроскоп </td><td> Олимп </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Объектива микроскопа </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 нА </td><td> λ = 258 нм </td></tr><tr><td> Объектива микроскопа </td><td> Олимп </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 А. </td><td> λ = 488 нм </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Безумный город Labs </td><td> Нано-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Моторизованный Перевод этап </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-серии 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP счетчик фотонов </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD камеры </td><td> Андор технологии </td><td> ПИН 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Гуанидингидрохлорида (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><tг&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

Процесс, посредством которого белок сворачивается в свою нативную конформацию имеет самое непосредственное отношение к биологии и здоровье человека еще до сих пор плохо изучены. Одна из причин этого является то, что складной происходит в широком диапазоне временных масштабов, от наносекунд до нескольких секунд или дольше, в зависимости от белков 1. Обычные остановил поток смесители позволили измерения складной кинетика, начиная примерно в 1 мс. Недавно мы разработали микрофлюидных микшер, который разбавляет денатуранта ~ 100 раз в ~ 8 мс 2. В отличие от остановленного потока смесителя, это миксер работает в режиме ламинарного потока, в котором турбулентности не происходит. Отсутствие турбулентности позволяет точно Численное моделирование всех потоков в смесителе с отличным соглашение экспериментировать 3-4. Ламинарного потока достигается при числах Рейнольдса Re ≤ 100. Для водных растворов, для этого требуется геометрии микронных размеров. Мы используем твердый субстрат, таких как кремний или плавленого кремнияса, чтобы каналы 5-10 мкм в ширину и 10 мкм глубоко (см. Рисунок 1). Самый маленький размер, на входе в смесительный области, составляет порядка 1 мкм. Чип с печатью тонкого стекла или плавленого кремнезема покровное для оптического доступа. Типичные общего линейной скорости потока ~ 1 м / с, что дает Re ~ 10, а потребление белка только ~ 0,5 нл / с или 1,8 мкл / час. Концентрация белка зависит от метода обнаружения: Для флуоресценции триптофана типичный концентрации 100 мкМ (на 1 Trp / белок) и FRET-типичная концентрация составляет ~ 100 нм. Складной процесс инициируется быстрого разведения денатурации от 6 м до 0,06 М гидрохлорида гуанидина. Белка в высоком денатуранта стекает центральный канал и встретился с обеих сторон в области смешения буферными без денатурации перемещение ~ 100 раз быстрее (см. Рисунок 2). Такая геометрия приводит к быстрому сужению белка поток в узкомструи ~ 100 нм. Распространение света денатурации молекулы очень быстро, в то время как распространение тяжелых молекул белков происходит гораздо медленнее, распространяя менее 1 мкм в 1 мс. Разница коэффициента диффузии и денатурации белков приводит к быстрому разбавлению денатурации белка из потока, снижение эффективной концентрации вокруг денатурации белка. Белок струйных течений с постоянной скоростью по каналу наблюдения и флуоресценции белка при складывать можно наблюдать с помощью сканирующего конфокальной микроскопии 5.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding at JoVE.com

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

В этой работе мы объясняем, изготовление и использование смесителя микрофлюидных способны смешения двух решений в ~ 8 мкс. Мы также продемонстрировать использование этих смесителей с спектроскопического обнаружения с использованием УФ-флуоресценции и флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET).

Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Микрожидкостных основе гидродинамической Ловушка для одиночных частиц

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Микрофлюидных устройство для изучения нескольких различных штаммов

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Микрожидкостных чип для МСПМС ввода пробы

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Слой за слоем Коллаген осаждения в микрофлюидных Устройства для стабилизации Microtissue

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Полностью автоматизированный центробежный Микрожидкостных Устройство для сверхчувствительного обнаружения белка из цельной крови

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...