Name: microfluidic mixers for studying protein folding
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00
Duration: 12 min 42 s
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Este trabajo es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias FIBR (NSF EF-0623664) y IDBR (NSF DBI-0754570). Este trabajo fue parcialmente financiado por fondos de la National Science Foundation Grant FIBR 0623664 administrado por el Centro para la Biofotónica, una Ciencia NSF y el Centro de Tecnología, gestionado por la Universidad de California en Davis, conforme al Acuerdo Cooperativo PHY 0120999. La investigación de Lisa Lapidus, Ph.D. está apoyado en parte por un premio a la Trayectoria en la interfaz de la Ciencia con cargo al Fondo Burroughs Welcome.

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No tenemos nada que revelar.

La mezcla rápida ha sido un objetivo de desarrollo para el campo de plegamiento de las proteínas durante muchos años, ya que hace tiempo se reconoce que los procesos moleculares de las biomoléculas se producen en escalas de tiempo que van desde picosegundos a los segundos. Convencionales de flujo detenido mezcladores tienen tiempos muertos de 5.1 ms, el cual está limitado principalmente por la turbulencia. Turbulentos mezcladores de flujo continuo con tiempos de mezcla de 30-300 mS se han desarrollado durante los últimos 15 años por un pequeño número de grupos, pero generalmente requieren altas velocidades de flujo para lograr estos tiempos de mezcla y por lo tanto, utilizan una gran cantidad de la muestra 6.8. Este protocolo se describe el uso de chips de microfluidos de mezcla para lograr una rápida dilución en el régimen de flujo laminar. Hay múltiples ventajas para trabajar dentro de este régimen, pero un uno primaria es la capacidad para simular el proceso de mezcla con alta precisión que permite una para modificar la respuesta de mezcla. T-mezcladores desarrollados por otros grupos con un simple geometríaetries han demostrado tiempos de mezcla de 100-200 mS que estaban limitados principalmente por el tamaño de los canales 9-10. Por escalar el tamaño de los canales a Knight micras 10 reduce el tiempo de mezcla a 10 ~ 11 mS. Yao y Bakajin mostraron que pequeños cambios en la geometría podría conducir a mejoras significativas en el tiempo de mezclado 4. Sin embargo, ese trabajo muestra que la aceleración de la mezcla también se puede llevar a más lentas fases también. El diseño utilizado en este trabajo 12 a 13 es un compromiso entre los dos mejores diseños en la referencia 4 para minimizar la descomposición más lenta exponencial de la concentración de desnaturalizante y también para hacer que la característica más reproducible en el grabado DRIE. Ha habido una cierta controversia en el campo de la mezcla ultrarrápida sobre la definición del tiempo de mezclado. Es importante reconocer la diferencia entre &quot;tiempo de mezcla&quot; y &quot;tiempo muerto&quot;. El tiempo muerto se define en un mezclador turbulento como el tiempo durante el cual un MEDIDASt no se pueden hacer y de hecho puede ser significativamente más largo que el tiempo de mezcla real. Se determina típicamente por hacer varias mediciones de una reacción de pseudo primer orden bimolecular (tales como enfriamiento de triptófano fluorescencia por N bromosuccinate) a diversas concentraciones. Los decaimientos exponenciales observados están equipados para converger en un solo valor supone que t = 0 s y el tiempo entre dicho punto y el primer punto medido es el tiempo muerto. Para mezcladores de flujo laminar, las mediciones se pueden hacer durante el proceso de mezclado así que no hay tiempo muerto, sólo un tiempo de mezclado. El tiempo de mezclado es simplemente el tiempo para combinar dos soluciones hasta uniformidad suficiente se alcanza. Hemos definido previamente el tiempo de mezcla para ser un tiempo 90/10, el tiempo para la concentración de desnaturalizante para disminuir de 90% a 10% del valor sin mezclar. Sin embargo, la forma de la curva de mezcla no es perfectamente simétrico con la cola de la caries que tiene un componente exponencial pequeño. Además, el plegamiento de proteínas tiene unaltamente no lineal dependencia de la concentración de desnaturalizante de modo que a menudo plegable puede comenzar incluso si el desnaturalizante sólo se reduce por dos veces. Por lo tanto, se han definido más recientemente el tiempo de mezcla como el tiempo para reducir la concentración desnaturalizante en un 80%. Ciertamente otras definiciones se pueden utilizar dependiendo de los requerimientos del experimento. El uso de este mezclador para estudiar el plegamiento de proteínas ha revelado consistentemente resultados sorprendentes. Plegado de citocromo C y apomyoglobin han sido estudiados para tener varios escalones plegables y los primeros resultados con los mezcladores de flujo continuo mostraron colapso que se produzca en el plazo de tiempo ~ 100 mS 10,14-15. Nuestras mediciones con este mezclador mostraba que había un mínimo de 2 pasos en esta escala de tiempo, un muy rápido, probablemente no específica, colapso (medida por fluorescencia Trp cambio espectral) dentro del tiempo de mezcla del mezclador seguido por una fase más lenta (como medido por el enfriamiento del total de emisiones Trp) que es probable que el frimero formación de la estructura nativa 5. También hemos observado un proceso de 50 mS en el dominio B1 de la proteína L, el vuelco a la interpretación convencional de que esta proteína es una carpeta de 2 estados 13. Una ventaja de este mezclador rápido es que se puede investigar el plegamiento de las proteínas más rápidas plegables que han sido por lo general sólo medible por nanosegundos salto de T-instrumentos. T-salto requiere típicamente observación de plegado / desplegado relajación cerca de la temperatura de fusión de la proteína y por lo tanto, nunca sigue el plegamiento de toda la población. Con este mezclador hemos visto en el plegamiento de las γ-represor (λ 6-86) tanto con las emisiones totales Trp y desplazamiento espectral y no han encontrado evidencia de que la proteína no tiene ningún obstáculo para doblar en condiciones de fuerte plegables que no eran accesibles a T anteriores -salta las medidas 12. Finalmente hemos medido el plegado de la pieza de cabeza villina HP-35, una de tél más rápidas carpetas todavía midió y se encontró que la tasa de plegado medido después de la mezcla es de ~ 5 veces más lento que medido por T-salto en las mismas condiciones 16. Esto sugiere que la cinética de plegado depende de las condiciones de partida, el vuelco una suposición importante en el campo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> AZ P4110 Fotoresinas </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K para desarrolladores </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PRS Baker 2000 fotosensible separador </td><td> Avantor Performance Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Tecnologías </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 oblea cubierta de m </td><td> SENSOR Servicios de preparación </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espesor: 0,5 mm ± 0,025 mm Tolerancias estándar (a menos que) Acabado de la superficie: SI: 4-8a; SII: 8-12a Pisos: Un Primaria SEMI-STD; un escriba Limpio y pulido, las dos caras </td></tr><tr><td> 170 oblea cubierta de m </td><td> SENSOR Servicios de preparación </td><td> 7980 2G Obleas </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espesor: 0,17 mm ± 0,025 mm Tolerancias estándar (a menos que) Acabado de la superficie: SI: 4-8a; SII: 8-12a Pisos: Un Primaria SEMI-STD; un escriba Limpio y pulido, las dos caras </td></tr><tr><td> Grabador profunda iones reactivos para los óxidos </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Láser de ion argón </td><td> Cambridge láser Laboratorios </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> l = 258 nm </td></tr><tr><td> Láser de ion argón </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> l = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Objetivo </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA </td><td> l = 258 nm </td></tr><tr><td> Microscopio Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> l = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad Labs Ciudad </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Traducción motorizado Etapa </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-serie 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon Contador </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monocrómetro </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Andor Technology </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Hidrocloruro de guanidina (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

El proceso por el cual una proteína se pliega en su conformación nativa es de gran importancia para la biología y la salud humana y aún poco conocidos. Una razón para esto es que plegado tiene lugar en un amplio rango de escalas de tiempo, de nanosegundos a segundos o más, dependiendo de la proteína 1. Convencionales de flujo detenido mezcladores han permitido la medición de la cinética de plegado a partir de alrededor de 1 ms. Recientemente hemos desarrollado un mezclador de microfluidos que diluye desnaturalizante ~ 100 veces en ~ 8 mS 2. A diferencia de un mezclador de flujo detenido, este mezclador opera en el régimen de flujo laminar en el que la turbulencia no se produce. La ausencia de la turbulencia permite la simulación numérica precisa de todos los flujos dentro de la mesa de mezclas con un acuerdo excelente para experimentar 3-4. El flujo laminar se logra para números de Reynolds Re ≤ 100. Para soluciones acuosas, esto requiere geometrías micras escala. Nosotros utilizamos un sustrato duro, tal como el silicio o silicio fundidoCA, para hacer micras canales 5-10 ancho y profundo 10 micras (Ver Figura 1). Las dimensiones más pequeñas, en la entrada a la zona de mezcla, son del orden de 1 micra de tamaño. El chip se sella con un vidrio delgado o cubreobjetos de sílice fundida para el acceso óptico. Las velocidades típicas del flujo total son lineales aproximadamente 1 m / s, dando Re ~ 10, pero el consumo de proteínas es sólo ~ 0,5 nl / s ó 1,8 l / h. La concentración de proteína depende del método de detección: Para triptófano fluorescencia la concentración típica es de 100 micras (1 para Trp / proteína) y para FRET la concentración típica es de ~ 100 nM. El proceso de plegado se inicia por dilución rápida de desnaturalizante de 6 M a 0,06 M de hidrocloruro de guanidina. La proteína en desnaturalizante alta fluye hacia abajo un canal central y se reunieron a ambos lados en la región de mezcla por tampón desnaturalizante sin mover ~ 100 veces más rápido (ver Figura 2). Esta geometría causa constricción rápida del flujo de proteína en un estrechochorro ~ 100 nm de ancho. La difusión de las moléculas desnaturalizantes de luz es muy rápida, mientras que la difusión de las moléculas de proteína pesados ​​es mucho más lenta, se difunden a menos de 1 micra de 1 ms. La diferencia en la constante de difusión del desnaturalizante y los resultados de proteínas en dilución rápida del desnaturalizante de la corriente de la proteína, lo que reduce la concentración efectiva del desnaturalizante alrededor de la proteína. El chorro de proteína fluye a una velocidad constante por el canal de observación y la fluorescencia de la proteína durante el plegado puede observarse usando un microscopio confocal de barrido 5.

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

En este trabajo se explica la fabricación y el uso de un mezclador de microfluidos capaz de mezclar dos soluciones en ~ 8 mS. También demuestran el uso de estos mezcladores con detección espectroscópica utilizando fluorescencia UV y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).

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