Name: non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

אנו מודים סטפן קוך לעזרה טכנית שלו שאנון לי Layland (הן IGB פראונהופר בשטוטגרט) עבור הצעות מועילות על כתב היד שלו. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי תוכנית למשוך את של Fraunhofer-Gesellschaft ו BMBF (הן KS-L.).

<ol>
	<li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy.">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation.">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li><li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation.">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li><li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy:+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro.">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues:+implications+for+long-term+graft+durability.">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li><li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+secondary+radiation.">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12 (1928).</li><li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+scattering+of+collagen,+gelatin,+and+elastin.">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li><li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants.">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li><li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues.">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li><li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+component+analysis.">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Spectroscopy:+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells.">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li><li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy.">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+elastic+tissue+biology:+elastin+isolation+and+purification.">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives.">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li><li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues.">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures.">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

ספקטרוסקופיית ראמאן היא כלי מתאים לנתח דגימות ביולוגיות, כמו במבחנה, בתרבית תאים וחלבונים ECM, כמו גם תאים בתוך רקמות מקומיות. 11,15,16 הנה, הראינו כי זה ללא מגע, ללא תווית הטכניקה מאפשרת אפליה של סוגי תאים שונים, זיהוי של פירוק חלבונים ECM מבוססת אך ורק על הרכב biomolecular הפנימי של אלה דגימות ביולוגיות. היתרון הגדול של ספקטרוסקופיית ראמאן היא היכולת הלא פולשני לכמת את טביעת האצבע ביוכימי של מדגם של ספקטרום ראמאן שהתקבל שלה. בניגוד ספקטרוסקופית אינפרא אדום, אשר מניב מידע דומה, ספקטרום ראמאן ניתן לאסוף דגימות מימית, כמו פיזור ראמאן מן המים חלש. בנוסף, ספקטרוסקופיית ראמאן מבוססת על זיהוי של backscattering של אור מונוכרומטי, ולכן לא נדרש עיבוד מדגם המדידה הקודמת. תכונות אלו הופכות את ראספקטרוסקופיה אדם אלטרנטיבה מבטיח פוטנציאל יישומי הדמיה ב vivo. לגבי זה, ספקטרוסקופיה קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (מכוניות) היא טכניקה מאוד מעניינת מכיוון שהיא מאפשרת מהר רכישת רגיש יותר של נתונים המבוססים על אותם אותות הרטט מנוצל בניסויים שלנו. 15,16 שיטות חלופיות אחרות, לרבות autofluorescence multiphoton הנגרמת ואת הדור השני הדמיה הרמונית הוכחו בעבר להיות מתאים ניטור פולשני דגימות ביולוגיות שאינן או מינימלית. 17 עם זאת, אלו שיטות הדמיה קשורים עלויות גבוהות מאוד מוגבלים autofluorescence להפקת מולקולות. בנוסף, ספקטרומטר ראמאן קל לשלב עם מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. תכונות אלו הופכות את ספקטרוסקופיית ראמאן כלי רב ערך כדי ללמוד דגימות ביולוגיות בסביבות פיזיולוגיים. אחת המגבלות הנוכחיות של ספקטרוסקופיית ראמאן שלנו היא להקיםמוקד לייזר קטן יחסית (250 ננומטר רוחב 1/2 לכל היותר (FWHM) לרוחב ו 700 ננומטר FWHM צירית), אשר נוצר על ידי המטרה צמצם גבוהה המספרי (NA = 1.2). אמנם צמצם המספרי גבוה מאפשר לכסות כמות טובה של האור הנפלט ראמאן מניב יחס אות לרעש גבוה, NA גבוהה מייצרת רק המיקוד אוסף קטן בתוך מדגם זה הוא בדרך כלל הרבה יותר קטן מאשר בתא. על מנת להשוות ספקטרום ראמאן של תאים שונים, אוסף של הספקטרום נציג חיוני, וזה קשה להשיג עם אזור המיקוד קטן. כדי לטפל בבעיה זו, אנו עובדים על התהליך כדי להפוך את האוסף האות בנקודות שונות בתוך התא (= מיפוי ספקטרוסקופיות ראמאן), וכתוצאה מכך רפאים בממוצע וכנוע למגוון מייצג. בנוסף, טכניקה זו תספק סקירה של חלוקת להקות ראמאן ספציפיים, למשל חלוקת חלבונים בתוך התא. Biolדגימות ogical הם מורכבים מאוד מורכב מתערובת הטרוגנית של ביומולקולות התורמים ספקטרום ראמאן אסף. לכן, דפוס ספקטרלי הוא מורכב מאוד את הפיקוח על סוג אחד של מולקולות בתוך ספקטרום ראמאן קשה להשיג עם חפיפה של אותות מולקולות שונות. בנוסף, הקרינה הפנימית של מדגם יכול להסתיר מידע בעל ערך של אותות ראמאן החלשות. מעניין לציין, כי בכמה מחקרים קודמים שלנו, זיהינו autofluorescence בספקטרום ראמאן כגורם מבדל העיקרי בין סוגי תאים (MSCs ו fibroblasts) באמצעות כלי הניתוח המתאים. 13 זיהינו גם שינויים בעוצמת האות הכולל ראמאן יכול לשמש אינדיקטור למצב של קולגן סיבי קולגן בתוך ECM של עלונים שסתום אבי העורקים. 9 עם זאת, כאשר מנתחים את מצב ואלסטין ברקמות אלה, לא הצליחו לזהות תוצאות דומות. כאמור בתוצאהבסעיף זה, היינו רק מסוגל לזהות שינויים של להקות ראמאן ספציפיים של elastase שטופלו דגימות בהשוואה לקבוצת הביקורת מקומיים. לא ראינו ירידה של האות ראמאן הכוללת את enzymatically שטופלו דגימות כצפוי. תצפיות אלו הביאו עלילה ציון כי לא חשף את היווצרות אשכול ברור כפי שניתן לראות במחקר הקודם. 9 לעומת זאת, ההשפעה של טיפול אנזימטי לא הורגש בתוך תוצאות PCA. אנו מניחים כי אלה פערים בין שני החלבונים ECM, וכן קולגן ואלסטין, מבוססים על הבדלים מורפולוגיים שונים ותהליכים השפלה אנזימטיות: בתוך העלון שסתום אבי העורקים, קולגן עשיר אזור (fibrosa) היא שכבה רציפה שהופך משוחרר עקב טיפול אנזימטי, לפיה ואלסטין המכיל אזור (ventricularis) יש תצורת הרשת המופיע מקוטעת לאחר חשיפה elastase (איור 4). מדידות ספוט יחיד ולכן לא היו המתאימהאכלו כדי לאתר קרעים קטנים כאלה בתוך הרשת ואלסטין. כאן, מיפוי ראמאן של רקמת יעזור לזהות תקלות ברשת. אתגר נוסף ספקטרוסקופיית ראמאן של דגימות ביולוגיות היא להפחית את זמני המדידה. פתרון אחד הוא להגדיל את כוח לייזר, אשר מתאים כל עוד דגימות ביולוגיות אינם מושפעים נזק תמונה. כל הניסויים הנוכחיים שלנו הם הוכחה של עקרון מחקרים המתמקדים במחקר בסיסי, עם זאת, המטרה הכללית שלנו היא ליישם ספקטרוסקופיית ראמאן עבור יישומים קליניים, כולל רפואה רגנרטיבית (למשל בקרת איכות של רקמות מהונדסות מוצרים), לפני השתלת ניטור שוחד אבחון סרטן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> elastase </td><td> וורטינגטון </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים נגד ואלסטין </td><td> סיגמא </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; ציטראט חיץ </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> בתחתית הזכוכית מנות </td><td> גריינר BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אופוס </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

טכנולוגיות שאינו הרסני, ללא מגע ו תווית ללא לפקח על תאים בתרביות רקמה יש צורך בתחום של מחקר ביו. 1-5 שיטות שגרתיות עם זאת, זמין כרגע לדרוש צעדים עיבוד ולשנות שלמות המדגם. ספקטרוסקופיית ראמאן היא שיטה מהירה, המאפשרת מדידה של דגימות ביולוגיות ללא צורך צעדים עיבוד נוסף. . זו טכנולוגיה מבוססת לייזר מזהה פיזור קשיח של אור מונוכרומטי 6 כמו בכל רעידות כימי מוקצה הלהקה ראמאן ספציפי (wavenumber ב -1 ס&quot;מ), כל דגימה ביולוגית כולל דפוס ספקטרלי טיפוסי בשל הרכב ביוכימי הטבוע בהם 7. - 9 בתוך ספקטרום ראמאן, את עוצמות השיא לתאם עם כמות את הקשרים המולקולאריים הנוכחי. 1 נקודות דמיון ושוני של ערכות נתונים ספקטרליים ניתן לאתר על ידי שימוש בניתוח רב משתני (קרן למשל רכיב ניתוח (PCA)). 10 </sup&gt; כאן, אנו מבצעים ספקטרוסקופיית ראמאן של תאים חיים ורקמות מקומיים. תאים זרע או על מנות התחתונה זכוכית או שמרו על ההשעיה בתנאים נורמליים התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לפני המדידה. רקמות הילידים הם גזור ומאוחסנים פוספט בופר סליין (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס מדידות קודמות. בהתאם קבוצת הניסוי שלנו, אנחנו מכן התמקדה גם על גרעין התא או תאית (ECM) מטריקס חלבונים כגון קולגן ואלסטין ו. עבור כל המחקרים, מינימום של 30 תאים או 30 נקודות אקראיות של עניין בתוך ECM נמדדים. מדרגות עיבוד נתונים כלל רקע חיסור ונורמליזציה.

Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ספקטרוסקופיית ראמאן היא טכניקה מתאימה ללא מגע, תווית ללא ניתוח של תאים חיים, רקמות מהונדסות בונה רקמות מקומיות. מקור ספציפיים טביעות אצבעות ספקטרלית ניתן להפיק נותחו באמצעות ניתוח רב משתני.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

יישום של מיקרוסקופ רפלקציה הפרעות עבור הדמיה ללא תווית, במהירות גבוהה של Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...