Name: non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

Biz el yazması üzerine yararlı önerileri için kendi teknik destek ve Shannon Lee Layland (Fraunhofer IGB hem Stuttgart) için Steffen Koch teşekkür ederim. Bu çalışma finansal Fraunhofer-Gesellschaft ve BMBF (KS-L hem de.) Ile Çekmek programı tarafından desteklenmiştir.

1. Biyolojik Numune Hazırlanması <ol><li> Yaşayan hücrelerin hazırlanması <ol><li> Yapışmış olan hücrelerin hazırlanması <ol><li> Cam bir alt çanak (Greiner BioOne / Almanya) ve 37 bunları tasarlamak üzerine in vitro-kültür veya taze izole hücrelerinde Tohum ° C ve% 5 CO 2 hücre eki tamamlanana kadar. </li><li> Kültür ortamı çıkartın ve PBS önce ölçümü ile yavaşça üç kere yıkayın. Bütün ölçüm işlemi boyunca PBS veya hücre kültür aracı ya kaplı hücreleri tutmak. </li></ol></li><li> Süspansiyon hücrelerin hazırlanması <ol><li> Ortak bir protokol (örn. tripsin-EDTA, hücre kazıma) &#39;ye göre vitro-kültürlenmiş hücrelerde ayırmak, hücreler santrifüj edilir ve elde edilen PBS içerisinde hücre peleti veya hücre kültür ortamı yeniden askıya. </li><li> Bir cam alt çanak için: hücre süspansiyonu 100 ul (max 100.000 hücre / ml. Konsantrasyon) aktarın. </li></ol></li></ol></li><li> Nat hazırlanmasıive dokuların <ol><li> Dokuların hasat edildikten sonra, 4 ° C&#39;de veya buz önce ölçümü 12 saatten daha steril, buz gibi soğuk PBS aktarmak ve artık onları tutun. Önceki deneyler uzun bir depolama süresi (4 ° C&#39;de soğuk iskemi zamanı&gt; 12 saat) doğal bozunma süreçleri nedeniyle spektral değişikliklere sebep olduğunu göstermiştir. </li><li> Ölçümler doku kurutma sonucu ECM proteinleri ve hücre hasarı önlemek için PBS veya orta kaplı doku ile gerçekleştirilmesi gerekir. </li></ol></li></ol> 2. Raman Spektrometresi Bizim özel Raman spektroskopisi Raman parlak alan ve floresan görüntülerin doğrudan karşılaştırma sağlayan bir Raman spektrometresi ile standart bir floresan mikroskop (Olympus IX 71) birleştirir. Temel set up 784 nm diyot laser (Toptica fotonik AG / Almanya), eksitasyon ışıktan Raman-dağınık ışık ayrılması için bir çentik filtresi, bir mikroskop, bir oluşurnd bir spektral bilgi (Yumuşak Görüntüleme Sistemleri / Almanya F-görüntülemek) tespiti için optimize edilmiş bir şarj bağlı cihaz (CCD kamera) ile spektrograf (Kaiser Optik Sistemleri A.Ş., Ann Arbor / Amerika). 3. Lazer Fonksiyon Kontrolü <ol><li> Yazılım Andor Solis (Andor / Birleşik Krallık) başlatın ve -60 CCD kamera sıcaklığını ayarlamak ° C kamera ısının neden akımların neden olduğu gürültüyü en aza indirmek için. </li><li> Kalibrasyon işlemi için mikroskop sahnede bir silikon yerleştirin. </li><li> Üzerine lazer açın ve gücü 85 mW ayarlanır. </li><li> XY görünene kadar gofret üzerine lazer odaklanmak için yazılım Hücre B (Olympus / Almanya) kullanın. </li><li> Bir 60x hava objektif kullanarak 1 sn tek bir entegrasyon süresi ile silikon ölçün. </li><li> Piksel sayısından Andor Solis yazılım Raman shift (cm -1) x-ekseninin birimini değiştirin. </li><li> 520 cm -1 silikon tepe lazer odak VaryBu Raman bandı için mümkün olan maksimum yoğunluğu bulmak için spektrum toplanır. Sayıları minimum tutar başarılı bir kalibrasyon için 11.000 &#39;den yüksek olmalıdır. </li></ol> 4. Raman Spektroskopik Ölçümler Tüm ölçümler oda sıcaklığında yapılır. <ol><li> Temel ayarlar <ol><li> Örneklerin spektrum toplamak için 1.2 sayısal bir diyafram ile 60x suya daldırma nesnel (Olympus / Almanya) kullanın. </li><li> Ölçümleri başına 100 saniye olmak üzere toplam 10 entegrasyonlar / 10 saniye satın ayarlarını değiştirin. </li></ol></li><li> Yapışkan hücreler ölçümü <ol><li> Hücreleri ile cam alt çanak alın ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. </li><li> Daha iyi bir sinyal almak ve tekrarlanabilirliği sağlamak, hücre çekirdeğinin üzerine lazer odaklanmak için, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. </li><li> Arka e bir referans spektrumu ölçünHücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek çok 10 spektrumları. Bu odak değiştirirken yeni bir arka plan her odak derinliği için toplanan gerektiğini dikkate almak önemlidir. </li></ol></li><li> Süspansiyon hücreleri Ölçümü <ol><li> Cam alt kabına hücre süspansiyonu 100 ul aktarın ve mikroskop sahneye yerleştirin. </li><li> Hücrenin merkezinde lazer odaklanın, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. </li><li> Hücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları ölçün. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. </li></ol></li><li> Yerli dokuların Ölçümü <ol><li> Örnek al ve cam bir alt tabak içine yerleştirin. Faiz getirisi (ROI) bölgesi tabağın tabanına dönük odaklı olmalıdır. </li><li> Örnek karşılamak için yeterli PBS ile çanak doldurun. </li><li> Herhangi mov önlemek için numune üzerinde cam bir kapakla yerleştirinölçümler sırasında numunenin ement. </li><li> Faiz yapısına lazer odağı ayarlayın (derinlik çözünürlüğü lazer ve doku bağımlı) ve spektrumları toplamaya başlar. </li><li> Bütün doku alanının lazer dışarı odaklanmak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları toplayın. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. </li></ol></li><li> Immünfloresan ölçümü (IF) etiketli cryosections <ol><li> Standart bir cryotom ve silis kaplı kapak gözlük takar kullanarak Bölüm taze, ek dondurulmuş doku örnekleri. </li><li> Sadece kısa bir fiksasyon adım (% 4 paraformaldehit ile en fazla 10 dakika) istihdam ve faiz protein tespiti için uygun antikorları kullanarak, IF için rutin bir protokolü takip cryosections Leke. </li><li> Floresans meydana alanda odaklanarak Raman ölçümleri gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Elastin bozulması deneyler <ol><li> Place cam alt tabağın tabanına dönük disseke domuz aort kapakçık (elastin açısından zengin, kalp kapak broşürün kan akışını tarafı katmanı) ventricularis. </li><li> Fibril yapıları odaklanarak bütün doku yüzeyi boyunca 30 rastgele noktalarda bir &#39;non-İnkübe kontrolü&#39; olarak doğal dokuya ölçün. </li><li> 3 bölüme örnek bölün ve bir elastaz çözüm (5 U / ml, Worthington / Almanya) 2 ml ile dolu ayrı 2,5 ml Eppendorf tüpler içine koyun. </li><li> 37, 15 ya da 30 dakika ya için doku inkübe ° C. </li><li> 15 ya da 30 dakika inkübasyondan sonra ya için, Eppendorf tüpüne gelen doku kaldırmak ve tamamen enzimatik reaksiyonu durdurmak için PBS ile dikkatle yıkanır. </li><li> Fibril yapıları odaklanarak, 30 rastgele noktalarda her bir örnek ölçün. </li></ol></li></ol> 5.. Veri İşleme ve Analizi <ol><li> Raman işleme Bir ön-muameleoluşturulan spektrumları OPUS yazılım (Bruker Optik GmbH / Almanya) kullanılarak yapıldı. <ol><li> Ölçümler sırasında odak değişikliklere neden olduğu farklılıklar önlemek için cam ve orta yanı sıra ile müdahale sinyalleri azaltmak amacıyla, alınan spektrumları karşılık gelen arka tayfı çıkarılır. </li><li> Bilgi en yüksek miktar sunuyor 400-1800 cm -1 arasında wavenumber bölgeye spektrumları azaltın. </li><li> Gerekirse, maksimum pik için spektrumları normalleştirmek. Örnek spektrumu yapısal değişikliklerin saptanması basitleştirilmesi yoğunluk dalgalanmaları ve sistematik arızaları, dışarı Normalizasyon faktörler. </li><li> Farklı deneyler arasındaki karşılaştırılabilirlik artırmak için temel bir düzeltme yapın. </li></ol></li><li> Raman analizi Raman Unscrambler (CAMO / Norveç) yazılımı ile PCA kullanılarak analiz edildi. Bu değişkenli analizde spektral verilerin içinde benzerlik ve farklılıkları algılarsetleri. Her spektrum her Raman vardiya toplanan sayıları dayalı çok boyutlu bir uzayda tek bir nokta olarak çizilir. Her bir temel bileşen (PC), orijinal veri içerdiği toplam bilgi belli bir miktar açıklanmaktadır. Birinci bilgisayar varyasyon yüksek kaynağı içeren biridir. Her aşağıdaki PC, sırayla, bir öncekine göre daha az bilgi içerir. Her değişkenin her PC&#39;de bir puan ve bir yükleme var. PC&#39;ler (= puan) çizerek, önemli bir örnek korelasyon gösterilebilir. Yüklemeler PCA her analiz değişkenin katkıları açıklayınız. <ol><li> Her örneklem grubu için satır aralıkları oluşturarak ölçümler her grup etiketleyin. </li><li> PCA için aşağıdaki temel ayarları kullanın: çapraz doğrulama, NIPALS algoritması, hiçbir rotasyon ve analizi başlatın. Bu ayarlar spektrumları bağlıdır. </li><li> PCA gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Raman spyapışık hücrelerinden oluşturulan ectra genellikle düşük sinyal-gürültü oranı ve düşük bir genel sinyal yoğunluğu (Şekil 1) lazer odak cam altında, müdahale etkisi yakın duzenlenmeli olması nedeniyle. 11 ortaya cam sinyali gerçek örnek sinyal maskeleme neden oldukça yüksektir. Bir sonraki geri çıkarma sırasında Bu nedenle, örneğin sinyal minimize olabilir veya hatta ortadan kaldırılmıştır. Onlar daha detaylı spektral bilgi algılanmasına izin olarak Böylece, biz, bizim Raman spektroskopik analiz için süspansiyon hücreleri kullanmayı tercih eder. Bununla birlikte, yapışık ve süspansiyon hücreleri spektrumları, sadece kendi yoğunluklarındaki farklı aynı temel zirveleri sergilerler. Bir süspansiyon içinde farklı hücre tiplerinin karakterizasyonu için, herhangi bir ön-muamele gereklidir. Süspansiyon ölçülen ortalama Raman ve insan fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler (MKH), kondrosit ve keratinositlerin standart sapma olarakŞekil 2 içinde gösterildiği. Bütün Raman benzer zirveleri (bkz. Tablo 1) protein, nükleik asit ve lipidler gibi tipik biyomoleküllerin menşeyli, yapılandırılmıştır. Bu hücre türleri için 12, 600 ve 1800 cm -1 en ilgili spektral bilgi içeren arasındaki spektral bölgede tarafından hangi belirgin farklılıklar farklı hücre tipleri (Şekil 2A) arasında algılanabilen edilir. Örnek, biz kollajen ve lipid moleküler titreşimler atanabilir olduğunu açıkça yapısal farklılıklar sergileyen bir spektral bölgede (1280-1350 cm -1) vurgulanır. Buna karşılık, morfolojik analizler çoğu hücrelerin tanımlanması ve ayrım (Şekil 2B-I) için uygun değildir. Kondrosit ve cilt hücreleri arasındaki fark (Şekil 2B, H karşı B, F ve E, I) gözlemlenebilir edilirken, fibroblast ve MKH sadece parlak alan micrsoc kullanarak ayırmak zorduropyala (Şek. 2B, F karşılık C, G). 13 Özellikle ECM proteinleri doğal dokuya, Raman spektroskopik analizi ROI ilgili yapısına odaklanmak edebilmek için, parlak alan görüntüleme ile görülebilmesi gerektirir. Belirli bir parmak izi spektrumu için bir proteinin atama için, piyasada bulunan saf protein ve immunohistologically lekeli cryosections arasında Raman oluşturulur. Burada, liyofilize elastin ve elastin karşı bir antikor istihdam immünfloresan lekeli cryosections karşılaştıran doğal dokuların içinde elastik liflerin parmak izi spektrumları belirledi. Elastin Raman yansıyan bir yüksek otofloresansı, özellikleri beri Ancak, veri analizi (Şekil 3A) zordur. Nedeniyle bu tür otofloresansı, veri kümelerinin uygun bir işleme gibi örnek özgü özellikleri sistematik başarısızlığı azaltmak için önemlidir. Bizim veriler biralyses, biz saf elastin protein anlamlı olarak daha yüksek sinyal yoğunluğu ortadan kaldırmak için normalleşme kullanılır ve bu nedenle, biz (Şekil 3B) karşılaştırılabilir Raman oluşturmak başardık. Elastin vücutta en istikrarlı ECM ​​proteinleri biridir ve aşağılamak için bu nedenle çok zordur. Bizim deneysel set up yılında 14, biz bir enzimatik sindirimi gerçekleştirerek sağlıklı domuz aort kapakçık elastin bozulmaya bağlı. Çok değişkenli analiz PCA uygulamak, biz enzimatik tedavi edilen örnekleri ve yerel denetimleri (Şekil 3C) ve Raman arasında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. Bu spektral farklar 861, 1003 ve 1664 cm -1 yükleme spektrumda gözlendi. Elastaz için uzun pozlama süreleri nedeniyle elastin lifleri içeren Beklenen yapısal değişiklikler de daha belirgin ayrılabilir skoru kümeler yansıdı HART Kullanıcı boyama (Şekil 4), (Şekil 3C) tarafından gösterildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Şekil 1. Müstakil ve yapışık fibroblastların Raman ortalama. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Şekil 2. (A) Raman ve dört farklı ilköğretim izole hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) ve standart sapmalar. Yapısal farklılıklar ile 1350 cm -1 - çerçeve 1280 spektral bölgede vurgulamaktadır. Müstakil (B) fibroblast (BE) Parlak alan görüntüleri, (C) MKH, (D) kondrosit ve (E) keratinositler. Ölçek bar 20 mikron eşittir. Yapışık (F) fibroblast (FI) Parlak alan görüntüleri, (G) MKH, (H) kondrosit ve (I) keratinositler. Ölçek bar 200 mikron eşittir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Şekil 3. Lyophili normalleşme olmadan (A) Ramanzed elastin (mavi çizgi), immünofloresan (IF) etiketli cryosections (turuncu çizgi) ve nativ aort kapakçık içinde ölçülen elastik lifler (kırmızı çizgi). Liyofilize elastin yüksek sinyal yoğunluğu otofloresans kaynaklanır. Normalleştirme sonrası (B) Raman sistemik hataları ortadan kaldırmak için. (C) skorları ve arıtılmamış kontrolü (kırmızı) ve enzimatik-bozulmuş (mavi ve yeşil) doğal doku içinde elastik lifler arasında karşılaştırma yükleri. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Şekil 4. HART&#39;s lekeli domuz aort kapakçık. Elastik lifler siyah canlandırırlar. (A) ve (B) arıtılmamış kontrolü ve (C) ve (D) 30 dakika boyunca elastin-bozundurucu enzimi elastaz maruz bırakıldı doku örnekleri tasvir göstermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Cm -1 wavenumber </strong&gt; </td><td colspan="2"> Atama 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipidler </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA bazları, OPO omurgası </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanin </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amid III </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH2 </td><td> Protein / Lipid </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amid IC = C </td><td> Protein Lipid </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bütün hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) spektrumu içinde algılanır Raman bantları.

<ol>
	<li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy.">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation.">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li><li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation.">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li><li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy:+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro.">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues:+implications+for+long-term+graft+durability.">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li><li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+secondary+radiation.">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12 (1928).</li><li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+scattering+of+collagen,+gelatin,+and+elastin.">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li><li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants.">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li><li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues.">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li><li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+component+analysis.">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Spectroscopy:+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells.">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li><li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy.">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+elastic+tissue+biology:+elastin+isolation+and+purification.">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives.">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li><li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues.">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures.">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Raman spektroskopisi doğal dokuların içinde in vitro-kültür hücreleri ve ECM proteinleri gibi hücrelerde gibi biyolojik örnekler, analiz için uygun bir araçtır. Burada 11,15,16, biz bu temassız, etiket serbest teknik olanak gösterdi farklı hücre tipleri ayrımcılık ve sadece bu biyolojik örneklerin içsel biyomoleküler bileşimine dayalı ECM protein yıkımı tespiti. Raman spektroskopisi büyük avantajı, non-invaziv bundan kaynaklanan Raman tarafından örnek bir biyokimyasal parmak izi ölçmek yeteneğidir. Benzer bilgiler verir kızılötesi spektroskopi, aksine, Raman zayıf su Raman saçılma olarak, sulu örneklerinden derlenen edilebilir. Buna ek olarak, Raman spektroskopisi, sadece tek renkli ışık saçılma tespit dayanmaktadır, bu nedenle, herhangi bir örnek işleme önceden ölçülmesi gereklidir. Bu nitelikler Ra yapmakin vivo görüntüleme uygulamaları potansiyel man spektroskopisi umut verici bir alternatif. Daha hızlı ve deneylerde kullanılan aynı titreşim sinyalleri dayalı verilerin daha duyarlı toplanmasını sağlayan beri bu gelince, tutarlı bir anti-Stokes Raman spektroskopisi (CARS) çok ilginç bir tekniktir. Multiphoton bağlı otofloresans dahil 15,16 Diğer alternatif yöntemler ve ikinci harmonik üretimi görüntüleme daha önce 17 Bununla birlikte, bu görüntüleme yöntemlerinin çok yüksek maliyetler ile ilişkilidir. olmayan veya minimal invazif biyolojik örneklerin izlenmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır ve otofloresans üreten molekülleri ile sınırlıdır. Buna ek olarak, Raman spektrometresi konvansiyonel optik mikroskop ile birleştirmek için kolaydır. Bu özellikler Raman spektroskopisi fizyolojik ortamlarda biyolojik örnekleri çalışmak için değerli bir araç haline getiriyor. Bizim Raman spektroskopisi mevcut kısıtlamalara biri kurmakyüksek sayısal açıklık objektif (NA = 1.2) tarafından oluşturulan nispeten küçük lazer odak (250 nm tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) lateral ve 700 nm FWHM eksenel). Yüksek sayısal açıklık yüksek sinyal-gürültü oranı veren yayılan Raman ışık iyi bir miktar kapsayacak olanak sağlasa da, yüksek NA tipik bir hücre daha küçük örneklem içinde sadece küçük bir toplama odak üretir. Farklı hücre Raman karşılaştırmak amacıyla, temsili bir spektrum toplama küçük bir odak alanı ile elde edilmesi zor olan, esastır. Bu sorunu gidermek için, ortalama ve temsili bir spektrum veren bir spektral sonuçlanan hücre içerisinde farklı noktalarda (= Raman spektroskopisi haritalama), az sinyal toplama otomatikleştirmek için bir süreç üzerinde çalışıyoruz. Buna ek olarak, bu yöntem, bir hücre içinde proteinin dağılımının, örneğin belirli Raman gruplarından dağılımının bir özetini temin edecektir. Biological örnekleri derece karmaşıktır ve toplanan Raman katkı biyomoleküllerin heterojen bir karışım oluşur. Bu nedenle, spektral desen derece karmaşıktır ve bir Raman spektrumu içinde bir molekülün bir tek tip izleme farklı molekül sinyalleri ile birlikte üst üste binen başarmak zordur. Ayrıca, örnek intrinsik floresans zayıf Raman sinyallerinin değerli bilgiler maskeleyebilir. İlginçtir, önceki bazı çalışmalarda, biz uygun bir analiz aracı kullanarak hücre tipleri (MKH ve fibroblastlar) arasındaki en önemli ayırıcı faktör olarak Raman otofloresan belirlendi. 13 Biz de genel Raman sinyal yoğunluğundaki değişiklikler olarak hizmet verebildiğini tespit kollajen ve aort kapak broşür ECM içinde kollajen liflerinin durumu için bir gösterge. 9 Ancak, bu dokularda elastin devlet değerlendirirken, benzer sonuçlar tespit edemedik. Sonuç olarak bahsedilens bölümünde, sadece yerli kontrollerle karşılaştırıldığında elastazı verilen örneklerinde spesifik Raman bantların değişiklikler tespit edebildi. Biz beklendiği gibi enzimatik tedavi örneklerinde genel Raman sinyalinin bir azalma görmedim. Bu gözlemler, önceki çalışmada görüldüğü gibi net bir kümelenme oluşumu vermedi.Bu bir puan komplo sonuçlandı. Aksine 9, enzimatik tedavi etkisi PCA sonuçları içinde algılanabilen edildi. Biz iki ECM proteinleri, elastin ve kolajen arasındaki bu farklılıklar morfolojik farklılıklar ve farklı enzimatik yıkım süreçleri dayalı olduğunu varsayalım: aort kapak broşürün içinde, kollajen zengin bölgesi (fibröz) nedeniyle gevşeyen için olur sürekli bir tabakadır enzimatik tedavisinde, bu sayede bölgesi (ventricularis) içeren elastin elastaz maruz (Şekil 4) sonra parçalanır görünen bir ağ konfigürasyona sahiptir. Tek nokta ölçümleri bu appropri değildielastin ağı içinde böyle küçük kopmalar tespit yedik. Burada, bir doku Raman haritalama ağ arıza belirlenmesine yardımcı olacaktır. Biyolojik örneklerin Raman spektroskopisi bir başka zorluk ölçüm zamanlarında azaltmaktır. Bir çözüm biyolojik örnekler foto-hasarı etkilenmediği sürece uygun lazer gücü, artırmaktır. Mevcut deneylerin tüm temel araştırma odaklanan proof-of-prensibi çalışmalar olmakla birlikte, bizim genel amacı, rejeneratif tıp (doku mühendisliği ürünlerinin örneğin kalite kontrolü), ön nakli greft izleme ve dahil olmak üzere klinik uygulamalar için Raman spektroskopisi uygulamaktır kanser teşhisi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> elastaz </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anti-elastin antikor </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75, sitrat tamponu </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> Cam alt yemekleri </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Hücre ve doku kültürleri izlemek için tahribatsız, temassız ve etiket içermeyen teknolojilerin biyomedikal araştırma alanında ihtiyaç vardır. 1-5 Ancak, şu anda rutin işleme yöntemleri gerektiren adımları ve örnek bütünlüğünü değiştirebilir. Raman spektroskopisi daha fazla işlem adımı için gerek olmaksızın biyolojik örneklerde ölçüm sağlar hızlı bir yöntemdir. . Bu lazer tabanlı teknoloji monokromatik ışık inelastik saçılma algılar 6 her kimyasal titreşim belirli bir Raman bant (cm -1 dalga sayısı) atanan gibi, her biyolojik örnek kendi içsel biyokimyasal bileşimi nedeniyle tipik bir spektral desen özellikleri 7. - Raman içinde 9, pik şiddetlerini mevcut moleküler bağlar miktarı ile ilişkilidir. 1 Benzerlikler ve spektral veri kümelerinin farklılıkları çok değişkenli bir analiz (örneğin temel bileşenler analizi (PCA)) kullanılarak tespit edilebilir. 10 </sup&gt; Burada, canlı hücreler ve doğal dokuların Raman spektroskopisi gerçekleştirin. Hücreler iki cam alt tabaklarının üzerine ekildi veya normal hücre kültürü koşulları altında süspansiyon muhafaza (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) ölçümü önce uygulanır. Doğal dokular 4 ° C de önceden ölçümleri (PBS) tamponlu tuzlu kesilir ve fosfat içinde depolanır. Bizim deney seti kadar bağlı, biz sonra da hücre çekirdeğinde veya elastin ve kollajen gibi ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri üzerine odaklanmıştır. Tüm çalışmaları için, 30 hücreleri veya ECM içinde ilgi 30 rastgele noktaları en az ölçülür. Veri işleme adımları arka plan çıkarma ve normalleşme dahildir.

Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...