Name: a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00
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La recherche dans le laboratoire Spagnoli. est financé par l&#39;Association Helmholtz, FP7-GRI-2008-ENDOPANC subvention et ERC-2009-Starting Grant hépatopancréatique.

Le protocole décrit ici a été adapté à la technique décrite à l&#39;origine de Percival et Slack 9 et optimisé pour la microscopie confocale. 1. Revêtement de plats Glass Bottom Culture Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Explants pancréatiques sont cultivées dans des boîtes de Pétri de 35 mm à 20 mm de diamètre en verre micropuits bas (par exemple...

<ol>
	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

Une fois le sort du pancréas est spécifié, les cellules progénitrices pancréatiques subissent une prolifération extensive, la différenciation et la morphogenèse, à terme, constituer un organe mature et fonctionnelle 2,4. À l&#39;heure actuelle, comment les branches se déroule dans le pancréas et la façon dont elle est reliée à la prolifération et la différenciation des progéniteurs est largement inconnue. Des cultures d&#39;explants pancréatiques représentent un système idéal pour éluci...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Anticorps: Carboxypeptidase E-cadhérine F-actine Le glucagon Insuline β1-intégrine Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 </td><td> AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes Immunostar Millipore Millipore Abcam Hybridome banque Signalisation cellulaire </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Eau de qualité culture cellulaire </td><td> AAP </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Boîtes de culture (à fond de verre), 35 mm </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G 0-20-C- </td><td></td></tr><tr><td> Sérum d&#39;Ane </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal Or </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Stock sol. 1 mg / ml dans de l&#39;eau de qualité culture cellulaire </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> 4-ainsi multipuits </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopes: Microscope confocal inversé (LSM 700) Stéréomicroscope (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Objectifs: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (travail. dist 1,8 mm;. Profondeur d&#39;imagerie ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (travail. dist 0,28 mm;. ~ Imagerie profondeur 50 um) Transillumination d&#39;en bas et à fibres optiques d&#39;éclairage par le dessus </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Roth </td><td> 0335.3 </td><td> Solution mère 20% </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur (verre), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td><td> Conservé dans c stérileonditions </td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri de 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri de 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> AAP </td><td> H15-002 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Printemps Ciseaux lame de 8 mm courbé </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> Horloger foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

Le pancréas contrôle les fonctions vitales de notre corps, y compris la production d&#39;enzymes digestives et la régulation de la glycémie 1. Bien que dans la dernière décennie de nombreuses études ont contribué à une base solide pour la compréhension de l&#39;organogenèse du pancréas, des lacunes importantes subsistent dans notre connaissance de la formation du pancréas au début 2. Une compréhension complète de ces événements précoces donnent un aperçu de l&#39;évolution de cet organe, mais aussi sur les maladies incurables qui ciblent le pancréas, comme le diabète ou le cancer du pancréas. Enfin, cette information sera générer un modèle pour l&#39;élaboration de cellules en remplacement des traitements dans le cadre du diabète. Au cours de l&#39;embryogenèse, le pancréas provient de différentes excroissances embryonnaires de l&#39;endoderme intestin antérieur dorsal et ventral à jour embryonnaire (E) 9,5 3,4 chez l&#39;embryon de souris. Les deux excroissances evaginate dans le mésenchyme environnant solide épithéliumbourgeons l, qui subissent la prolifération, la différenciation et de branchement pour générer un organe pleinement matures 2,5,6. Des preuves récentes ont suggéré que la croissance et la différenciation des lignées de cellules pancréatiques, y compris les productrices d&#39;insuline des cellules β, dépend de la bonne tissulaire architecture, remodelage épithélial et le positionnement cellulaire dans l&#39;épithélium pancréatique de branchement 7,8. Cependant, comment morphogenèse de ramification se produit et est coordonné avec la prolifération et la différenciation dans le pancréas est largement inconnue. Ceci est en partie dû au fait que les connaissances actuelles sur ces processus de développement reposait presque exclusivement sur l&#39;analyse des échantillons fixés, alors que les événements morphogénétiques sont très dynamiques. Ici, nous présentons une méthode pour disséquer et de la souris en culture du pancréas embryonnaire ex vivo sur des bourgeons plats à fond de verre, ce qui permet la visualisation directe du pancréas en développement (figure 1). Ce culteure système est idéalement conçu pour la microscopie confocale à balayage laser et, en particulier, imagerie des cellules vivantes. Explants pancréatiques peuvent être préparés non seulement à partir d&#39;embryons de souris de type sauvage, mais aussi à partir de souches de souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out par exemple), ce qui permet en temps réel des études de phénotypes mutants. En outre, ce système culture ex vivo est précieux pour étudier les effets des composés chimiques sur le développement du pancréas, ce qui permet d&#39;obtenir des données quantitatives sur la prolifération et la croissance, l&#39;allongement, la ramification, tubulogenèse et la différenciation. En conclusion, le développement d&#39;une méthode in vivo du pancréas culture ex explant combiné avec l&#39;imagerie haute résolution fournit une base solide pour l&#39;observation d&#39;événements morphogénétiques et de différenciation tels qu&#39;ils se présentent dans l&#39;embryon de souris en développement.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ici, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une excellente<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système pour l&#39;étude des divers aspects du développement du pancréas, y compris la morphogenèse, la différenciation et la croissance. Explants de bourgeons pancréatiques peuvent être cultivées pendant plusieurs jours et utilisé dans une variété d&#39;applications différentes, y compris l&#39;ensemble de montage immunofluorescence et imagerie en temps réel.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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