Name: a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00
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Research in Spagnoli laboratório. é financiado pela Associação Helmholtz, FP7-IRG-2008-ENDOPANC concessão e ERC-2009-Começando Grant hepatopâncreas.

O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir da técnica originalmente descrita em Percival e Slack 9 e optimizados para a microscopia confocal. 1. Revestimento de pratos de vidro cultura de fundo Os passos que se seguem devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. <ol><li> Explantes pancreáticas são cultivadas em placas de Petri de 35 mm com 20 mm de diâmetro de vidro de micropoços de fundo (por exemplo</e...

<ol>
	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

Uma vez que o destino é especificado pancreático, de células progenitoras do pâncreas sofrer proliferação extensiva, a diferenciação e a morfogénese para eventualmente formar um órgão funcional maduro e 2,4. No presente, como a ramificação ocorre no pâncreas e como ele é ligado a proliferação e diferenciação de células progenitoras é em grande parte desconhecida. Culturas de explantes de pâncreas representa um sistema ideal para elucidar esses processos ex vivo 5,9,11.</sup...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Anticorpos: Carboxipeptidase E-caderina F-actina Glucagon Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-Histona H3 </td><td> Abd Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hibridoma banco Sinalização celular </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Médio Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Água de grau de cultura de células </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Placas de cultura (com fundo de vidro), de 35 mm </td><td> MatTek Corporação </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Donkey soro </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo Ouro </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Estoque sol. 1 mg / ml em água de grau de cultura de células </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> 4-bem multiplacas </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópios: Microscópio confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscópio (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Objetivos: C Apochromat-10X / 0,45 W M27 (work. dist 1,8 mm;. Profundidade de imagem ~ 100 mm); Apochromat C-40X / 1,2 W Corr M27 (work. dist 0,28 milímetros;. ~ Profundidade de imagem 50 mm) Transiluminação partir de baixo e de fibra óptica de iluminação a partir de cima </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Roth </td><td> 0.335,3 </td><td> Solução-mãe de 20% </td></tr><tr><td> Pasteur Pipeta (vidro), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Mantido em c estérils condições </td></tr><tr><td> As placas de Petri, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Primavera Tesoura lâmina de 8 mm curvo </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Foreceps relojoeiro Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

O pâncreas controla as funções vitais do nosso corpo, incluindo a produção de enzimas digestivas e regulação dos níveis de açúcar no sangue 1. Embora na última década muitos estudos têm contribuído para uma fundação sólida para a compreensão organogênese pâncreas, importantes lacunas persistem em nosso conhecimento da formação do pâncreas precoce 2. Uma compreensão completa dos eventos iniciais vão fornecer informações sobre o desenvolvimento do órgão, mas também de doenças incuráveis ​​que visam o pâncreas, como o diabetes ou câncer de pâncreas. Finalmente, esta informação vai gerar um modelo para o desenvolvimento de terapias de substituição de células no contexto da diabetes. Durante a embriogénese, o pâncreas origina distintas excrescências embrionárias da endoderme foregut dorsal e ventral no dia embrionário (E) 9,5 no embrião de rato 3,4. Ambas as excrescências evaginate no mesênquima circundante como epitélios sólidobotões L, que se submetem a proliferação, diferenciação e ramificação para gerar um órgão totalmente madura 2,5,6. Evidências recentes sugerem que o crescimento e diferenciação de linhagens de células, incluindo pancreáticas produtoras de insulina das células β, depende do tecido adequado arquitetura remodelação, epitelial e posicionamento de célula dentro do epitélio pancreático ramificação 7,8. No entanto, como a ramificação ocorre morfogénese e é coordenada com a proliferação e diferenciação no pâncreas é em grande parte desconhecida. Isto é em parte devido ao facto de que o conhecimento actual sobre os processos de desenvolvimento baseou-se quase exclusivamente na análise de amostras fixadas, enquanto que os eventos morfogenéticos são altamente dinâmico. Aqui, apresentamos um método para dissecar e cultura embrionárias de camundongos pancreático ex vivo gemas em pratos de vidro de fundo, o que permite a visualização direta do pâncreas em desenvolvimento (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente concebido para a microscopia confocal laser scanning e, em particular, de imagem ao vivo de células. Explantes pancreáticas podem ser preparados não apenas a partir de embriões de rato de tipo selvagem, mas também a partir de estirpes de murganhos geneticamente modificados (por exemplo transgénico ou knockout), permitindo tempo real estudos de fenótipos mutantes. Além disso, este sistema de cultura ex vivo é útil para estudar os efeitos de compostos químicos sobre o desenvolvimento pancreático, permitindo a obtenção de dados quantitativos sobre a proliferação e crescimento, alongamento, ramificação, tubulogenesis e diferenciação. Em conclusão, o desenvolvimento de um método de pâncreas ex vivo cultura explante combinada com imagens de alta resolução fornece uma plataforma forte para observar eventos morfogenéticos e diferenciação à medida que ocorrem dentro do embrião de rato em desenvolvimento.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma excelente<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema para estudar vários aspectos do desenvolvimento do pâncreas, incluindo a diferenciação morfogênese e crescimento. Explantes broto pancreático pode ser cultivada por vários dias e usado em uma variedade de aplicações diferentes, incluindo todo-mount imunofluorescência e imagem ao vivo.

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

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Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

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