Name: a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas at JoVE.com

Forskning inom den Spagnoli labbet. finansieras av Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC bidrag och ERC-2009-Starta HEPATOPANCREATIC Grant.

Protokollet som beskrivs här har anpassats från den teknik som ursprungligen beskrivs i Percival och Slack 9 och optimerad för konfokalmikroskopi. 1. Beläggning av kultur Glass Bottom rätter Följande steg bör utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. <ol><li> Pankreatiska explantat odlas i 35-mm petriskålar med 20-mm glas mikrobrunn botten (t.ex. Mattek Corporation). Använd en maträtt glasbotten per explant...

<ol>
	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

När pankreatisk öde anges, pankreatiska progenitorceller genomgår omfattande proliferation, differentiering och morfogenes för att slutligen bilda en mogen och fungerande organ 2,4. För närvarande sker hur förgrening rum i bukspottkörteln och hur det är anslutet till stamfader proliferation och differentiering är i stort sett okänd. Pankreas explantation kulturer är ett idealiskt system för att belysa dessa processer ex vivo 5,9,11. Genom att kombinera levande cell imaging med...

<table border="1"><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Antikroppar: Karboxipeptidas E-cadherin F-aktin Glukagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Fosfor-histon H3 </td><td> ABD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridom bank Cell Signal </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12.373 20.076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Förvaras i sterila betingelser </td></tr><tr><td> Cellodling grad vatten </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Förvaras i sterila betingelser </td></tr><tr><td> Kultur rätter (glasbottnad), 35-mm </td><td> Mattek Corporation </td><td> P35G-0-20-C- </td><td></td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum Guld </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Förvaras i sterila betingelser </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Stock sol. 1 mg / ml i cellkultur klass vatten </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Förvaras i sterila betingelser </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Förvaras i sterila betingelser </td></tr><tr><td> 4-väl multiskålar </td><td> Nunc </td><td> 176.740 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop: Inverterad konfokalmikroskop (LSM 700) Stereomikroskop (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Mål: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (work. Dist 1,8 mm,. Imaging djup ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (work. Dist 0,28 mm,. ~ Imaging djup 50 um) Genomlysning underifrån och fiberoptiska belysning ovanifrån </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Roth </td><td> 0.335,3 </td><td> Stamlösning 20% </td></tr><tr><td> Pasteurpipett (Glas), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Förvaras i sterila cILLKOR </td></tr><tr><td> Petriskålar, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628.102 </td><td></td></tr><tr><td> Petriskålar, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627.161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Förvaras i sterila betingelser </td></tr><tr><td> Spring Sax 8 mm klinga böjd </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Urmakare foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

Bukspottkörteln styr vitala funktioner i vår kropp, inklusive produktionen av matsmältningsenzymer och reglering av blodsockret 1. Även under det senaste decenniet många studier har bidragit till en stabil grund för att förstå bukspottskörteln organogenesen, viktiga luckor kvar i vår kunskap om tidig bukspottkörteln bildas 2. En fullständig förståelse av dessa tidiga händelser kommer att ge inblick i utvecklingen av detta organ, men också till obotliga sjukdomar som riktar bukspottkörteln, såsom diabetes eller cancer i bukspottkörteln. Slutligen kommer denna information genererar en plan för att utveckla cell-substitutionsbehandlingar i samband med diabetes. Under embryogenes, kommer bukspottkörteln från distinkta embryonala utväxter av den dorsala och ventrala framtarmen endoderm vid embryonal dag (E) 9,5 i musembryot 3,4. Båda utväxter evaginate in i den omgivande mesenkym som fast epitell knoppar, som genomgår förökning, förgrening och differentiering för att generera en fullt utvecklad orgel 2,5,6. Nya bevis har föreslagit att tillväxt och differentiering av linjerna pankreatiska cell, inklusive de insulinproducerande β-celler, beroende korrekt vävnads-arkitektur, epitelial ombyggnad och cell positionering inom förgrening bukspottkörteln epitel 7,8. Men hur förgrening morfogenes sker och samordnas med proliferation och differentiering i bukspottkörteln är i stort sett okända. Detta beror delvis på det faktum att dagens kunskap om dessa utvecklingsprocesser har förlitat nästan uteslutande på analys av fasta prover, medan morfogenetiska händelser är mycket dynamiska. Här rapporterar vi en metod för att dissekera och odling mus embryonala knoppar pankreas ex vivo på rätter glas botten som gör direkt visualisering av utvecklingsländerna bukspottkörteln (figur 1). Denna kulture-systemet är idealiskt utformat för konfokal laserskanning mikroskopi och, i synnerhet, live-cell imaging. Pankreatiska explantat kan framställas inte bara från vildtyp musembryon, utan också från genetiskt modifierade musstammar (t.ex. transgena eller knockout), möjliggör realtid studier av mutanta fenotyper. Dessutom är denna ex vivo odlingssystem värdefullt att studera effekterna av kemiska föreningar på pankreatisk utveckling, gör det möjligt att erhålla kvantitativa data om proliferation och tillväxt, töjning, förgrening, tubulogenesis och differentiering. Sammanfattningsvis ger utveckling av en ex vivo bukspottskörteln explantat odlingsmetod i kombination med hög upplösning avbildning en stark plattform för att observera morfogenetiska och differentiering händelser när de inträffar i utvecklingsländerna musembryo.

Watch this Scientific Journal Video about A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas at JoVE.com

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Här beskriver vi en metod för isolering, kultur och manipulering av mus embryonala pankreas. Detta utgör en utmärkt<em&gt; Ex vivo</em&gt; För att studera olika aspekter av bukspottskörteln utveckling, inklusive morfogenes, differentiering och tillväxt. Pankreatiska knopp explantat kan odlas i flera dagar och användes i en rad olika tillämpningar, inklusive hel-mount immunfluorescens och levande bildåtergivning.

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

En Ex-ovo Kyckling Embryo Culture lämpligt för bildbehandling och mikrokirurgi Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Ett system för odling Iris Pigment epitelceller att studera Lens Regenerering vid Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

En 3D-system för odling mänskliga Artikulära chondrocyter i ledvätskan

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En metod för odling av embryonala<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Kultur av Mouse embryonala Hud-och Live-avbildning av Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur systemet studerar Thyroid Utveckling

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

In vitro Bukspottkörteln Organogenesis från spridda Mouse Embryonala stamfäder

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...