Name: visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00
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Ce travail a été financé par la société Max Planck.

1. Préparation de l&#39;échantillon <ol class="lalpha"><li> Préparation des lamelles Lamelles doivent être nettoyés des particules de poussière que la FRBR est sensible aux signaux de fond découlant de la lamelle (fig. 1A, Film 1). <ol><li> Utilisation de bordereaux de pinces de couverture placer dans un support en céramique avec couvercle. </li><li> Remplissez le récipient en verre avec NaOH 1 M (peut être réutilisé plusieurs fois). </li><li> Incuber pendant 2 h sous une rotation c...

<ol>
	<li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy.">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li><li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microscopy.">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria.">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+it,+switch+it,+bounce+it,+pull+it:+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics.">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li><li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide,+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis.">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li><li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics:+Generating+randomness+by+formin(g)+and+moving.">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li><li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V.">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li><li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain.">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li><li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li></ol>

Microscopie TIRF est la technique de choix aux protéines d&#39;image périphériques. La profondeur de pénétration faible du champ évanescent minimise de sortir de la lumière mise au point, ce qui conduit à un signal de très bonne à bruit et permet l&#39;acquisition de données à des vitesses élevées, ou d&#39;imagerie de protéines exprimées très faiblement. La combinaison de contraste élevé et taux de rafraîchissement élevé rend microscopie TIRF un outil parfait pour l&#39;imagerie dynamique spatio-t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;outil / réactif </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Outil </td><td> Uniequip </td><td> UNITWIST ROCKER 3-D SHAKER </td></tr><tr><td> Microscope TIRF </td><td> Jusqu&#39;à </td><td></td><td> Configuration personnalisée </td></tr><tr><td> Récipient en verre </td><td> Outil </td><td> VITLAB </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Support de coloration en céramique </td><td> Outil </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavaline A </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Lamelles # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscope </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Microscope </td><td> Menzel Glaser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Immersion dans l&#39;huile </td><td> Microscope </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Réactif </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Réactif </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy

Microscopie TIRF a émergé comme une technologie d&#39;imagerie puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelles de molécules fluorescentes in vitro et dans des cellules vivantes 1. Le phénomène optique de réflexion interne totale se produit lorsque la lumière passe à partir d&#39;un milieu d&#39;indice de réfraction élevé dans un milieu à indice de réfraction faible à un angle plus grand qu&#39;un angle caractéristique critique (plus près d&#39;être parallèle à la limite). Bien que toute la lumière est réfléchie dans de telles conditions, une onde évanescente est créée qui se propage à travers et le long de la frontière, ce qui diminue de façon exponentielle avec la distance, et ne pénètre que les zones d&#39;échantillonnage qui sont près de 100-200 nm de l&#39;interface 2. En plus de fournir supérieure résolution axiale, l&#39;excitation réduit de sortir de fluorophores de discussion crée un signal très élevé des ratios de bruit et minimise les effets néfastes de photoblanchiment 2,3. Être une technique widefield, la FRBR permet également d&#39;image plus rapide en courant alternatifquisition que la plupart des configurations basées sur la numérisation confocale. À première vue, la faible profondeur de pénétration de la FRBR semble être incompatible avec l&#39;imagerie de cellules bactériennes et fongiques, qui sont souvent entourés de parois cellulaires épaisses. Au contraire, nous avons constaté que les parois cellulaires des levures et des cellules bactériennes réellement améliorer la convivialité de la FRBR et d&#39;accroître l&#39;éventail des structures observables 4-8. De nombreux processus cellulaires peuvent donc être directement accessible par la FRBR dans de petits micro-organismes monocellulaires, qui offrent souvent de puissantes techniques de manipulation génétique. Cela nous permet d&#39;effectuer des expériences in vivo biochimie, où la cinétique des interactions entre protéines et les activités peuvent être évaluées directement dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici les différentes étapes nécessaires à l&#39;obtention des images de grande qualité pour TIRF Saccharomyces cerevisiae ou des cellules de Bacillus subtilis. Nous signaler des problèmes divers qui peuvent affect FRBR visualisation des sondes fluorescentes dans les cellules et d&#39;illustrer la procédure avec plusieurs exemples d&#39;applications. Enfin, nous démontrons comment les images TIRF peut encore être améliorée en utilisant des techniques de restauration d&#39;image.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie est une approche puissante pour observer des structures à proximité de la surface de la cellule au contraste élevé et une résolution temporelle. Nous montrons comment la FRBR peut être utilisée pour étudier la dynamique des protéines au niveau du cortex des parois cellulaires fermés cellules bactériennes et fongiques.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

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Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

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Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

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