Name: visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00
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Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft finanziert.

1. Probenvorbereitung <ol class="lalpha"><li> Vorbereiten Deckgläser Deckgläser sollten von Staubpartikeln gereinigt werden wie TIRF ist durch Hintergrundgeräusche Signale aus dem Deckglas (Abb. 1A, Movie 1). <ol><li> Mit einer Pinzette Ort Deckgläser in einer Keramik mit Deckel. </li><li> Füllen Glasbehälter, der mit 1 M NaOH (kann wiederverwendet werden mehrere Male). </li><li> Inkubieren für 2 h unter langsamer kontinuierlicher Rotation (Orbitalschüttler). Übermäßige Inkubation (&...

<ol>
	<li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy.">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li><li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microscopy.">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria.">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+it,+switch+it,+bounce+it,+pull+it:+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics.">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li><li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide,+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis.">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li><li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics:+Generating+randomness+by+formin(g)+and+moving.">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li><li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V.">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li><li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain.">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li><li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li></ol>

TIRF-Mikroskopie ist die Technik der Wahl, um Bild peripheren Proteinen. Die geringe Eindringtiefe der abklingenden Feldes minimiert von außerhalb des Fokus Licht, das zu einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis führt und ermöglicht die Datenerfassung mit hoher Frame-Raten, oder Abbildung von sehr schwach exprimierte Proteine. Die Kombination aus hohem Kontrast und hoher Bildraten TIRF-Mikroskopie macht ein perfektes Werkzeug für die Abbildung raum-zeitliche Dynamik von kortikal lokalisierte Proteine. Interessante...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Werkzeugs / Reagenz </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Orbitalschüttler </td><td> Werkzeug </td><td> Uniequip </td><td> UniTwist 3-D Wippschüttler </td></tr><tr><td> TIRF-Mikroskop </td><td> Bis </td><td></td><td> Individuelle Einrichtung </td></tr><tr><td> Verpackung aus Glas </td><td> Werkzeug </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Keramische Färbebank </td><td> Werkzeug </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalin A </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Deckgläser # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Mikropräparate </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Gläser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Immersionsöl </td><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy

TIRF-Mikroskopie hat sich als leistungsfähige Imaging-Technologie, um raum-zeitliche Dynamik der fluoreszierenden Moleküle in vitro zu untersuchen und in lebenden Zellen 1 entstanden. Die optische Erscheinung der Totalreflexion auftritt, wenn Licht von einem Medium mit hohem Brechungsindex zu einem Medium mit niedrigem Brechungsindex unter einem Winkel größer als eine charakteristische kritische Winkel (dh näher an parallelen wobei mit der Grenze). Obwohl alle Licht wird unter solchen Bedingungen widerspiegelt, wird eine abklingende Welle erzeugt, breitet sich über und entlang der Grenze, die mit Abstand exponentiell abklingt, und dringt nur Bereiche, die Probe 100-200 nm in der Nähe der Schnittstelle 2 sind. Neben der Bereitstellung überlegener axiale Auflösung, erstellt der reduzierten Anregung aus dem Fokus Fluorophore ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und minimiert schädliche Auswirkungen von Photobleaching 2,3. Als Weitfeld-Technik, TIRF erlaubt auch schnellere Bild acErwerb als die meisten Scan-basierte konfokale Setups. Auf den ersten Blick scheint die geringe Eindringtiefe der TIRF für unvereinbar mit Bildgebung von Zellen von Bakterien und Pilzen, die häufig mit dicken Zellwänden umgeben sind. Im Gegenteil haben wir festgestellt, dass die Zellwände von Hefe-und Bakterienzellen tatsächlich verbessern die Nutzbarkeit von TIRF und erhöhen die Reichweite von beobachtbaren Strukturen 4-8. Viele zelluläre Prozesse können somit direkt von TIRF werden in kleine, einzellige Mikroorganismen, die häufig bieten starke genetische Manipulation Techniken abgerufen. Dies ermöglicht uns, In-vivo-Experimente Biochemie, wo Kinetik von Protein-Interaktionen und Aktivitäten, die direkt in lebenden Zellen beurteilt werden durchführen können. Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte erforderlich, um qualitativ hochwertige Bilder für TIRF Saccharomyces cerevisiae oder Bacillus subtilis-Zellen zu erhalten. Wir weisen darauf hin verschiedene Probleme, die kann affect TIRF Visualisierung von fluoreszierenden Sonden in Zellen und illustrieren das Verfahren mit mehreren Anwendungsbeispielen. Schließlich zeigen wir, wie TIRF Bilder weiter verbessert werden kann mit etablierten Techniken Bildrestaurierung.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Forschung

Biotechnik

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...